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烯醇化酶(enolase,2-phospho-D-glycerate hydrolyase)作为糖酵解过程的限速酶,能催化磷酸甘油(PGA)向磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的转化,也能催化其逆向反应过程,因此烯醇化酶在细胞能量代谢过程中起着重要的作用。越来越多的研究证明烯醇化酶属于一个新的蛋白家族,称为兼职功能蛋白(moonlighting protein),具有多种与细胞病理生理等活动相关的功能,例如参与细胞凋亡、炎症反应以及病菌感染等过程。棉铃虫(Helicoverpa armigera(Lepidoptera:Noctuidae))作为世界性重要的农业害虫,目前主要利用Bt(Bacillus thuringiensis,Bt)毒素来控制其为害。然而随着Bt棉的大面积推广,棉铃虫对Bt毒素产生的抗性机制将会影响Bt棉长期有效的应用,所以了解烯醇化酶与棉铃虫Bt抗性之间的关系是十分重要的。本研究以棉铃虫作为实验对象,首次克隆得到该基因完整的编码区序列,开放阅读框长1302bp,编码432个氨基酸;该基因在许多物种中均存在且高度保守,与同属夜蛾科的斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的序列相似性分别达到97.69%和97.23%,预测其编码蛋白质的分子量为46.83kDa,等电点为5.98,无跨膜结构域和信号肽。荧光定量qRT-PCR分析烯醇化酶基因的表达谱,发现烯醇化酶基因在5龄幼虫的不同组织中均有表达,且在头部中的表达量最高,在前肠、中肠、后肠和马氏管中的表达量相对最低;另外,在棉铃虫的整个生长发育阶段也均有表达,在卵和蛹期的相对表达量最低,而在4龄幼虫中的相对表达量最高。通过构建绿色荧光指示蛋白GFP融合表达载体,转染BTI-Tn-5B1-4(Hi5)细胞系,在激光共聚焦显微镜下发现棉铃虫烯醇化酶分布于整个细胞中,但主要集中分布于细胞核内,且在胞质中部分蛋白呈点状分布。利用原核表达系统表达棉铃虫烯醇化酶蛋白,Western blot和质谱对表达的蛋白进行分析鉴定,发现该蛋白分子量约为50 kDa。经镍离子亲和层析纯化出的棉铃虫烯醇化酶蛋白,可用于制备抗体。分析棉铃虫Bt敏感品系和抗性品系烯醇化酶的核苷酸和氨基酸序列差异,发现核苷酸序列发生不同程度的碱基突变,并且低抗品系(LF5.0)和高抗品系(LF240.0)同其它的抗感品系相比,LF5.0有一个氨基酸发生了突变,而LF240.0有6个氨基酸发生了突变,并且突变发生在烯醇化酶的C端结构域,突变造成的生物学影响还有待进一步的研究。通过分析棉铃虫敏感品系和抗性品系烯醇化酶基因的mRNA表达量差异,发现Bt抗性品系的表达量均高于敏感品系,而中抗品系LF20.0和LF30.0的相对表达量较高。比较棉铃虫敏感品系和抗性品系中肠组织中烯醇化酶基因表达丰度也发现抗性品系高于敏感品系。棉铃虫烯醇化酶的表达分布与细胞的病理生理环境以及代谢的旺盛程度相关,烯醇化酶于虫体的生长发育、营养代谢等生命活动中在机体的能量来源方面可能起着重要的作用。抗性品系烯醇化酶水平的变化可能引起了中肠能量的变化来适应这种抗性环境。烯醇化酶是否与棉铃虫Bt抗性相关还有待从蛋白等水平进行更深层次的研究。