一、研究目的:丙型肝炎病毒是全球性传染性疾病病原体,其感染可以保持无症状数年。据估计,全世界只有5%的丙型肝炎病例被确诊,而大量未经诊断治疗的HCV携带者成为病毒传染源和传播者,HCV的感染以300-400万/年的新发病例数在全球蔓延,仍然是世界范围内的主要公共卫生问题。在治疗上具有突破性发展的直接口服抗病毒药物仅在少数发达国家上市,由于价格十分昂贵,也限制了其推广应用,而且DAAs治疗不能阻止或预防HCV的流行,进一步强调了疫苗研制的重要性。研制一种有效的HCV疫苗用于预防HCV感染已被世界卫生组织列为当务之急（WHO 2017）。与HCV同为黄病毒科的寨卡病毒自1947年在乌干达寨卡丛林的恒河猴中发现,到2007年在西太平洋密克罗尼西亚联邦的雅浦岛首次暴发流行一直未得到广泛的关注,但随着2015年巴西暴发大规模的婴儿小头畸形病例,病毒感染的潜在危害引起全球重视。2016年2月1日,世界卫生组织宣布将ZIKV及小头症列为全球紧急公共卫生事件。目前还没有针对ZIKV的特异性抗病毒治疗或疫苗,鉴于ZIKV感染的迅速传播,加快对寨卡病毒疫苗的研发对该病的防治至关重要。故本研究利用腺病毒AdMax包装系统,分别将编码经过改造的HCV囊膜蛋白E1E2基因和编码ZIKV包膜蛋白prM-E基因重组到E1缺失的复制缺陷型5型腺病毒载体上构建复制缺陷型重组腺病毒,分别测定E1E2和prM-E在293细胞中的表达,并在小鼠体内检测其免疫原性。二、研究方法1.HCV囊膜蛋白重组人腺病毒5型载体的构建与免疫原性测定以HCV Z14（样品编号为Z14的肇庆HCV 1b型献血者）基因为模板扩增获得结构蛋白CoreE1E2基因片段。对E2序列N端进行改造,以一个人为模拟表位F78片段（已经被证实能够在免疫小鼠及家兔体内诱导产生针对高变区HVR1不同变体的交叉反应抗体）替换E2的HVR1序列,并加入一段信号肽序列C19aa来增强目的蛋白的表达,获得C19aaE1F78E2片段。将获得片段作为免疫原连接到AdMax系统的穿梭载体pDC315上,通过细胞内同源重组的方法包装复制缺陷型重组腺病毒rAd5/C19aaE1F78E2,病毒空斑纯化获得单一稳定的病毒株后在293A细胞中大量扩增,通过CsCl密度梯度离心法浓缩纯化,并用TCID50法测定病毒滴度。以不同剂量（108、109、1010和1011）PFU的重组病毒肌肉注射免疫C57BL/6小鼠,第3周加强免疫,第5周眼球取血,分离小鼠脾脏淋巴细胞,采用ELISpot（固相酶联免疫斑点技术）和ICS（细胞内细胞因子染色法）检测特异性T细胞免疫反应,ELISA（酶联免疫吸附试验）检测免疫后小鼠体液免疫反应。2.ZIKV包膜蛋白重组人腺病毒5型载体的构建与免疫原性测定从ZIKV毒株Z16006（亚洲型）分离获得prM-E基因片段连接穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒载体pDC315/prM-E。同rAd/C19aaE1F78E2构建的方法,以重组腺病毒AdMax系统包装重组腺病毒rAd5/prM-E。选用C57BL/6小鼠接种不同剂量（107PFU、108PFU和109PFU）的rAd5/prM-E,分别以ELISpot和ELISA方法测定小鼠针对ZIKV prM-E产生的细胞与体液免疫反应。三、结果1.HCV囊膜蛋白重组人腺病毒5型载体的构建与免疫原性测定酶切鉴定及测序结果证明包含HCV目的基因片段的重组穿梭质粒载体pDC315-C19aaE1F78E2构建成功;Western blot及免疫荧光结果证明成功获得具有感染性且表达HCV囊膜蛋白的重组腺病毒rAd/C19aaE1F78E2,纯化后获得病毒以108、109、1010和1011 PFU四个剂量进行肌肉注射免疫C57BL/6小鼠,第3周加强免疫,第5周小鼠眼球取血并分离脾脏淋巴细胞。以ELISpot方法测得四个剂量rAd/C19aaE1F78E2免疫组小鼠特异性斑点形成细胞数（SFCs）分别为 349.20±94.28、259.20±60.82、442.80± 127.61、487.20±146.82,均显著高于同等滴度接种rAd/EGFP对照组的小鼠（最高为20.00±5.00）,（P＜0.05）;四个剂量免疫小鼠分泌IFN-γ+CD8+T淋巴细胞占总的CD8+T淋巴细胞的比例分别为（1.11±0.12）%、（1.20±0.25）%、（1.71±0.41）%和（1.71 ±0.27）%,显著高于rAd/EGFP对照组（最高值（0.39±0.08）%）,（P＜0.01）。以ELISA方法检测免疫后小鼠血清针对HCV E2蛋白的特异性抗体,以免疫后小鼠血清OD值高于基准2倍（S/CO＞2）的最高稀释度的倒数定义抗体滴度并以Log10值表示分别为2.63±0.13、2.72±0.34、2.78±0.34和3.32±0.55,与对照组小鼠血清抗体滴度（最高为0.49±0.20）之间差异显著（P＜0.001）。2.ZIKV包膜蛋白重组人腺病毒5型载体的构建与免疫原性测定实验构建了复制缺陷型重组腺病毒载体rAd5/prM-E,采用Western blot方法以抗ZIKV E抗体检测rAd5/prM-E感染的293A细胞,可见与E蛋白相应的56kDa蛋白带。以重组腺病毒107、108和109PFU三个剂量肌肉注射小鼠,在第3周同等剂量加强免疫一次,第5周小鼠眼球取血并分离脾脏淋巴细胞。以ELISpot方法测定小鼠脾淋巴细胞特异性IFN-γ分泌细胞形成斑点数,结果分别为688.54±186.43、1084.90±144.14、1640.20±147.13 SFCs/106 细胞,与病毒接种剂量呈正比关系;采用ELISA测定免疫小鼠血清中抗E抗体,其滴度（Log10值）分别为3.14±0.39、3.50±0.30和3.74±0.25,呈现病毒接种剂量依赖关系;同时实验组小鼠血清抗体滴度均高于接种109PFU的rAd5/EGFP对照组的小鼠（0.80±0.17）,且差异具有统计学意义（P＜0.001）。四、结论本研究成功以人腺病毒5型载体分别构建了含HCV囊膜蛋白C19aaE1F78E2和ZIKV包膜蛋白prM-E的复制缺陷型重组腺病毒表达载体。rAd5/C19aaE1F78E2和rAd5/prM-E均具有感染小鼠并诱导产生强烈的特异性抗体和细胞免疫反应能力,为丙型肝炎病毒和寨卡病毒候选疫苗的研制提供了可靠的免疫原。