目的卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤，恶性度高，易于盆腹腔广泛种植转移，形成腹水，70％的病例就诊时已为晚期，治疗上通常是行肿瘤细胞减灭术和规范的化疗，尽管最初化疗反应率达70-80％，但复发较早，发生耐药率高，预后极差，5年生存率仅为35-38％。卵巢癌恶性腹水是肿瘤细胞腹膜腔浸润和转移的结果，是患者死亡的主要原因之一。卵巢浆液性囊腺癌的特点是病灶位于卵巢的表面，表面肿瘤细胞脱落，种植于覆盖网膜和肠管表面的间皮，形成广泛的腹腔转移，因此，浆液性卵巢癌，最常见的转移方式是腹膜腔和腹腔器官的浆膜面种植性转移。卵巢浆液性囊腺腹膜播散转移是一个多阶段、序贯的复杂过程。Ben等人研究发现卵巢浆液性囊腺癌的腹膜播散转移包括以下几个连续的步骤：①肿瘤细胞间粘附力降低，病灶表面肿瘤细胞脱落；②肿瘤细胞膜受体结合胶原、纤维连接蛋白和层连接蛋白，粘附于细胞外基质；③蛋白水解酶导致基底膜和细胞外基质降解；④肿瘤细胞侵入增殖，新生毛细血管生成等。在肿瘤的发生发展中，由于肿瘤生长迅速，其增生速度超过周围血管的生长速度，导致局部缺氧，进而诱导HIF-1α的表达，可见HIF-1α不仅是调节氧动态平衡的关键因子，而且与肿瘤的演进关系密切。对缺氧的耐受性和新生血管的形成是实体瘤发生、发展和转移过程中不可缺少的两个方面。在缺氧环境下肿瘤细胞多基因表达，其中缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是细胞耐受缺氧的主要调节因子之一。肿瘤的发生、发展分为无血管期和血管期。无血管期的肿瘤直径一般小于1—2mm，不会发生浸润、转移。新生血管形成后肿瘤细胞成数倍增长，转移机会随之增高，即血管期的肿瘤能诱导血管生成，肿瘤细胞迅速增殖，并有转移的潜能。因此，直径超过1—2mm的实体癌瘤的生长需要新生血管的介人和支持，阻断诱导血管形成通路，可干涉肿瘤的血供建立，引起肿瘤细胞坏死，凋亡或呈冬眠状态。肿瘤血管生成包括内皮细胞增殖、迁移及细胞外基质降解等多个步骤和复杂的过程，其首要环节是肿瘤血管生成因子产生过多，使之与抑制因子失衡。在已知的促血管生成因子中，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是最重要的血管生长刺激因子。α干扰素（Interferon-α，IFN-α）是一种多功能的细胞因子，干扰病毒合成，抑制肿瘤细胞增殖，调节免疫反应。IFN-α的抗肿瘤作用是多方面的。目前认为，IFN-α除有直接的抗肿瘤作用，还有间接的抗肿瘤作用，新近的研究表明，IFN-α还能作用于癌组织的血管内皮而抑制肿瘤生长。目前IFN-α与卵巢浆液性囊腺癌侵袭和腹腔播散转移中血管形成的关系还不十分清楚。本实验通过检测了52例卵巢浆液性囊腺癌组织中HIF-1α、VEGF、bFGF、CD34蛋白的表达情况，及上述因子在31例晚期患者腹水及转移灶中的表达情况，探讨HIF-1α、VEGF、bFGF在卵巢癌发生、发展、腹水形成和腹膜播散中的作用，探讨其与预后的关系。建立卵巢浆液性囊腺癌细胞株低氧模型，检测在低氧条件下IFN-α干预后，HIF-1α、VEGF、bFGF的蛋白表达变化，研究IFN-α在低氧条件下对卵巢浆液性囊腺癌细胞株OVCAR₃增殖和血管生成的作用，进一步探讨IFN-α抑制卵巢浆液性囊腺癌腹腔播散转移的机制。材料与方法一、病例资料自2001年8月～2005年1月在中国医科大学第一临床学院诊断为卵巢浆液性囊腺癌的病人52例，所有病例均经术后病理证实，由同一病理专家复核确认。患者年龄22～71岁，平均（45.2±12.3）岁，术前均未接受放射治疗及化学药物治疗。病理分化程度：高分化11例，中分化16例，低分化25例；临床分期[按国际妇产科联盟（FICO）标准，2000年]：Ⅰ期10例，Ⅱ期10例，Ⅲ期30例，Ⅳ期2例；无腹水者21例，有腹水者31例。其中3例行全子宫切除，双附件切除术，41例行肿瘤细胞减灭术，残留病灶直径≤2cm（其中4例行部分结肠或直肠切除术），8例行肿瘤细胞减灭术，残留病灶直径＞2cm。其中49例患者术后给予CP或TP方案化疗6-8个疗程，52例患者中21人复发。所有患者均随访（随访时间22个月-39个月），随访内容包括：盆腔检查、CA125测定、盆腹腔超声检查，术后头两年，3个月一次，以后6个月一次。另外，对有腹水的31例晚期患者，分别取腹水沉渣和腹腔转移灶进行检测，转移灶部位：23例为大网膜，3例为阑尾，3例为腹壁，2例为结肠。卵巢浆液性囊腺瘤20例，年龄20～76岁，平均年龄（42.7±13.5）岁，卵巢交界性浆液性囊腺瘤9例，年龄20～71岁，平均年龄（47.7±15.2）岁，正常卵巢组织10例，年龄为28～66岁，平均年龄为（48.3±11.6）岁。二、材料鼠抗人HIF-1α多克隆抗体、survivin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗人VEGF、bFGF单克隆抗体，鼠抗人tubulin单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，鼠抗人CD34、PCNA单克隆抗体购自北京中山试剂公司，二抗羊抗鼠、羊抗兔单克隆抗体购自北京中山试剂公司，VEGF和bFGF试剂盒购于美国R&D公司，bFGF购自深圳晶美试剂公司，IFN-αⅡb购于北京三元基因公司，4℃保存，PI购自美国Sigma公司，CoCL₂购自沈阳化学试剂厂，ECL发光试剂盒购自美国PE公司。三、方法1、肿瘤组织原发灶和转移灶HIF-1α、VEGF、bFGF、CD34、PCNA免疫组化检测，采用S-P免疫组化二步法。2、腹腔液细胞HIF-1、VEGF、bFGF免疫细胞化学检测，采用EnVision免疫细胞化学染色法。3、血清和腹腔液上清VEGF及bFGF水平检测，采用双抗体夹心ELISA法。4、采用CoCL₂建立细胞化学性低氧模型。5、采用MTT法测定增殖率和抑制率。6、采用FACScan流式细胞仪进行细胞凋亡检测和细胞周期解析。7、采用Western blot解析细胞株HIF-1α、VEGF、bFGF和survivin的蛋白表达。实验结果1、HIF-1α、VEGF、bFGF蛋白在卵巢浆液性囊腺癌中的高表达率明显高于正常卵巢组织和卵巢浆液性囊腺瘤，其差异有显著性（P＜0.001）；而且HIF-1α、VEGF、bFGF蛋白在卵巢交界性浆液性囊腺瘤的高表达率也高于正常卵巢组织和卵巢浆液性囊腺瘤，差异有显著性（P＜0.001）。2、低分化、Ⅲ期+Ⅳ期和腹水阳性HIF-1α蛋白的高表达率明显高于高中分化、Ⅰ期+Ⅱ期和腹水阴性者，差异具有显著性（P＜0.05）；HIF-1α蛋白表达与年龄无关，差异无显著性（P＞0.05）。3、HIF-1α蛋白高表达与VEGF、bFGF高表达及MVD具有明显的正相关（P＜0.01），150μmol／LCoCL2处理OVCAR₃细胞24小时，可上调细胞HIF-1α和VEGF蛋白表达，对bFGF蛋白表达无影响。4、常氧培养条件下，不同浓度的bFGF作用OVCAR₃细胞24小时，25、50和100ng／ml的bFGF均上调OVCAR₃细胞HIF-1α蛋白表达，且呈浓度依赖性（P＜0.01）；50 ng／ml的bFGF分别作用OVCAR₃细胞6、12、24和48小时，均上调OVCAR₃细胞HIF-1α蛋白表达，且呈时间依赖性（P＜0.01）。5、HIF-1α、VEGF蛋白在31例晚期卵巢浆液性囊腺癌原发灶、转移灶中的表达高于腹水中的表达（P＜0.05），bFGF蛋白在原发灶、转移灶和腹水的高表达率分别是83.9％、90.3％和61.3％，无显著差异（P＞0.05）。6、卵巢浆液性囊腺癌患者血清中VEGF、bFGF平均水平明显高于正常对照、卵巢浆液性囊腺瘤和卵巢交界性浆液性囊腺瘤患者（P＜0.05），腹水中VEGF、bFGF平均水平明显高于血清（P＜0.01）。7、残留病灶、HIF-1α、VEGF、bFGF高表达及MVD与卵巢浆液性囊腺癌的复发或转移具有明显的正相关（P＜0.05）。Cox模型分析，VEGF高表达及MVD是晚期卵巢浆液性囊腺癌的独立预后因素（P＜0.05）。8、150μmol／LCoCL₂作用48小时诱导OVCAR₃细胞G₀／G₁期阻滞，未见明显凋亡。9、150μmol／LCoCL₂作用24小时下调survivin蛋白表达，survivin蛋白表达与HIF-1α呈负相关（P＜0.001）。10、低氧培养条件下，10²、10³和10⁴IU／ml的IFN-αⅡb均下调OVCAR₃细胞HIF-1α、VEGF蛋白表达，且呈浓度依赖性（P＜0.05）。浓度为10² IU／ml的IFN-αⅡb分别作用OVCAR₃细胞6、12、24和48小时，HIF-1α、VEGF蛋白表达均下调，且呈时间依赖性（P＜0.05）。11、浓度为10²IU／ml的IFN-αⅡb作用72小时和10³IU／ml的IFN-αⅡb作用48、72小时和10⁴IU／ml的IFN-αⅡb作用24、48、72小时对OVCAR₃细胞的增殖均具有一定的抑制作用（P＜0.05）。12、低氧培养24小时，10³和10⁴IU／ml的IFN-αⅡb诱导OVCAR₃细胞S-G₂／M期阻滞，在本实验中，未见明显细胞凋亡。13、低氧培养条件下，10²、10³和10⁴IU／ml的IFN-αⅡb均下调OVCAR₃细胞survivin蛋白表达，与对照相比，差异显著（P＜0.001），无浓度依赖性（P＞0.05）。讨论恶性肿瘤在生长过程中，由于组织生长过快必然会造成局部组织严重缺氧和供能与耗能之间的不平衡。HIF-1α能通过诱导血管内皮生长因子（VEGF）和糖酵解相关酶的表达，增加供血、供氧、供能，改善这一失衡状态。目前已证实HIF-1α与肿瘤的发生、发展、浸润、转移和预后密切相关，是在肿瘤的发病过程中起重要作用的核调控转录因子。大量研究证实，血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤血管生成中起重要的作用，迄今为止认为是最重要的血管生成因子。VEGF是一种多功能细胞因子，它可诱导肿瘤血管形成，增加血管通透性，协助肿瘤细胞进入脉管系统，促进肿瘤侵袭转移。bFGF属于成纤维细胞生长因子家族（FGFs），它可以直接刺激内皮细胞的增生，促进内皮细胞产生蛋白酶，调节内皮细胞表面整合素的表达，促进内皮细胞的迁移，从而促进肿瘤血管生成。在许多实体肿瘤的研究中，发现HIF-1α呈高度表达，并发生于肿瘤早期，在肿瘤血管形成和侵袭发生前已发现HIF-1的mRNA水平与其转移能力相关。本实验结果表明，用免疫组化检测HIF-1α蛋白表达水平，正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺瘤、卵巢交界性浆液性囊腺瘤及卵巢浆液性囊腺癌高表达率为分别为0、10％、44.4％和65.4％，呈上升趋势。可见HIF-1α在卵巢肿瘤由良性向恶性转化发展过程中可能起着某种重要的作用。HIF-1α蛋白在临床晚期、低分化、有腹水的卵巢浆液性囊腺癌中呈现高表达，差异具有显著性，说明HIF-1α的高表达与其生物学特性是一致的。肿瘤生长迅速往往导致组织的血液供应不足而发生缺氧坏死，诱导HIF-1α蛋白的表达。在HIF-1α蛋白高表达的组织中，PCNA的高表达率为67.6％，表明二者密切相关。HIF-1α可通过激活多种靶基因的转录，提高葡萄糖转运、糖酵解及形成血管体系，可促进卵巢癌细胞快速分裂增殖，导致肿瘤发生恶性转化。卵巢癌中HIF-1α促进肿瘤血管生成是通过对VEGF表达的调节实现的，即HIF-1α促进肿瘤生长的关键在于促进肿瘤血管生成。卵巢浆液性囊腺癌在生长过程中，由于组织生长过快必然会造成局部组织严重缺氧，诱导HIF-1α蛋白表达，而HIF-1α蛋白又上调VEGF表达，VEGF促进肿瘤血管生成，在其他因子（β₁整合素、E-钙粘素、CD44、MMP-9、MMP-2）的协同作用下，促进卵巢浆液性囊腺癌侵袭和腹腔转移，而VEGF还可增高血管通透性，促进腹水的形成，同时腹水形成也利于肿瘤细胞进入腹腔，为肿瘤细胞的腹腔种植创造条件，种植于腹膜表面的肿瘤细胞又进一步刺激腹膜表面血管，增高其通透性，形成更多的腹水。晚期卵巢浆液性囊腺癌原发灶、转移灶中HIF-1α、VEGF、bFGF高表达，说明这些因子与卵巢浆液性囊腺癌的侵袭和腹膜转移密切相关，且转移灶中高于原发灶，说明癌细胞在离开原发灶、接触腹膜、种植生长的过程中，经历了低氧的过程，诱导了HIF-1α高表达，活化了一些因子（包括VEGF）的转录，促使转移灶的形成。HIF-1α、VEGF蛋白在腹水中的表达率低于原发灶和转移灶，可能是由于肿瘤细胞的微环境发生改变，失去了与间质细胞的相互作用和信号传导，导致腹水中HIF-1α和VEGF表达下调。bFGF蛋白在31例晚期卵巢浆液性囊腺癌转移灶中均高表达，说明bFGF是进展期卵巢浆液性囊腺癌侵袭和腹腔转移的重要血管生成因子。bFGF不仅与VEGF协同促进肿瘤血管生成，而且还上调VEGF的表达，在本实验中，发现bFGF在常氧下，可以上调卵巢癌细胞株OVCAR₃ HIF-1α蛋白表达，而且呈剂量时间依赖性，进而上调VEGF表达，亦说明bFGF是卵巢浆液性囊腺癌肿瘤血管生成中最重要的血管生成因子。在本研究中，发现残留病灶大小、HIF-1α、VEGF、bFGF高表达及MVD均与卵巢浆液性囊腺癌的复发或转移成正相关，而且多因素分析结果显示VEGF高表达和MVD是卵巢浆液性囊腺癌的独立预后因子，在本实验中，150μmol／LCoCL₂诱导G₀／G₁期阻滞，150μmol／LCoCL₂作用OVCAR₃细胞24、48、72小时的增殖率分别为98％，97.8％和97.5％，但与对照相比无显著差异（P＞0.05）。150μmol／LCoCL₂作用OVCAR₃细胞24小时，HIF-1α蛋白表达增加，survivin蛋白表达降低，二者具有明显的负相关。说明HIF-1α抑制OVCAR₃细胞增殖，是通过降低survivin蛋白表达，诱导G₀／G₁期细胞阻滞实现的，在本实验中，未见明显凋亡，说明survivin在卵巢癌低氧模型中仅参与细胞周期的调控，和细胞增殖有关，未参与细胞凋亡的调节。因缺氧将使细胞周期减慢甚至停止，G₀／G₁期细胞增加，而化疗药物对增生旺盛的细胞有比较强的杀伤活性，因此缺氧将降低化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，导致肿瘤细胞对化疗药物的耐受，另有报道缺氧时HIF-1α可启动MDR1基因的转录，进一步提高耐药性，导致复发或转移。在本研究中，发现IFN-α抑制低氧诱导的卵巢癌细胞OVCAR₃ HIF-1α和VEGF表达，而且呈剂量时间依赖性，在我们既往的临床研究中，发现IFN-α可以控制卵巢癌患者腹水的形成，抑制腹腔转移或复发，可能与下调VEGF蛋白表达有关。低氧条件下，浓度为10²IU／ml的IFN-αⅡb作用72小时和10³IU／ml的IFN-αⅡb作用48、72小时和10⁴IU／ml的IFN-αⅡb作用24、48、72小时对OVCAR₃细胞的增殖均具有一定的抑制作用，作用24小时，10³和10⁴IU／ml的IFN-αⅡb诱导S-G₂／M期阻滞，我们发现IFN-αⅡb抑制低氧状态下卵巢癌细胞OVCAR₃survivin蛋白表达，但与浓度无关，说明IFN-αⅡb抑制OVCAR₃细胞增殖，是通过降低survivin蛋白表达，诱导S期细胞阻滞实现的，在本实验中，未见明显凋亡，说明survivin仅参与细胞周期的调控，和细胞增殖有关，未参与细胞凋亡的调节。可见，IFN-αⅡb主要通过下调survivin蛋白表达，诱导S-G₂／M期阻滞和下调HIF-1α和VEGF表达抑制卵巢癌的增殖和腹腔转移，抑制腹水的形成。结论1、HIF-1α、VEGF和bFGF在卵巢浆液性囊腺癌发生、侵袭和腹膜转移中有重要的作用。2、bFGF通过上调卵巢癌OVCAR₃细胞HIF-1α蛋白表达而促进VEGF蛋白表达。3、VEGF及MVD是晚期卵巢浆液性囊腺癌的独立预后因素。4、HIF-1α下调survivin蛋白表达，诱导G₀／G₁期细胞阻滞，上调VEGF蛋白表达，促进肿瘤血管生成。5、IFN-αⅡb通过下调survivin蛋白表达，诱导S-G₂／M期阻滞和下调HIF-1α蛋白表达抑制卵巢癌OVCAR₃细胞VEGF蛋白表达，抑制OVCAR₃细胞的增殖和腹腔转移。