论文部分内容阅读
胰腺β细胞在葡萄糖刺激下表现典型的双相分泌反应,完全的双相分泌是健康β细胞的标志,糖尿病伴随着胰岛素双相分泌的受损。40多年来,胰岛素双相分泌的细胞生物学基础一直存在很大的争议。一般认为胰岛素的双相分泌对应于不同类型的囊泡库,已锚定和成熟的囊泡(RRP)对应于第一相分泌,而可释放囊泡的补充则构成第二相分泌。但是双相分泌的产生是一个多因子参与的极其复杂的过程,进一步阐明其机理具有重要意义。Munc13是C. elegans Unc-13和Drosophila Dunc-13在哺乳动物中的同系物,有四种亚型,是SNARE蛋白的调节蛋白之一。Munc13-1/unc13基因敲除使神经突触不能形成RRP囊泡,从而使神经递质释放被完全阻断。Munc13蛋白含C2结构域和可与DAG结合的C1结构域。DAG/佛波醇结合到C1结构域增强了Munc13-1促囊泡成熟的能力,但是在内分泌LDCV囊泡上,Munc13的作用尚不清楚。本课题以Munc13-1基因敲除小鼠(KO)和Munc13-1H567K点突变小鼠(KI)为研究对象,系统研究了Munc13-1在胰岛素分泌及其在DAG信号调控过程中的作用。主要实验结果如下:1) Munc13-1基因敲除小鼠出生后几个小时内死亡,我们发现培养2-3天的新生小鼠β细胞表现典型的成年小鼠β细胞特点,如Na+通道失活及对葡萄糖的响应等。本培养方法的成熟为以出生致死型基因敲除小鼠为模型研究胰岛素分泌的分子机制奠定了基础。2)虽然Munc13-1在神经递质的释放过程中是不可缺少的因子,但它在内分泌大致密核心囊泡(LDCV)分泌的作用却尚不清楚。我们以膜电容检测和光解释钙技术相结合,发现在Munc13-1 KO小鼠中,延迟型组分的分泌几乎完全被抑制,KI小鼠中也明显降低。但是代表可释放囊泡分泌的簇发型分泌相却没有明显改变。连续去极化实验得到类似的结果,RRP排空后的恢复时间常数在KO小鼠中也明显延长。表明Munc13-1是胰岛素延迟相分泌所必需的,直接证明Munc13-1对长时程刺激下LDCV的补充起作用。由于Munc13-1的缺失使神经突触不能形成RRP囊泡,而在β细胞中却是正常的,说明Munc13-1在神经突触囊泡和LDCV的分泌中起着不同的作用。3)胰岛素双相分泌的产生机理尚有待阐明,我们以ELISA检测Munc13-1基因敲除小鼠胰岛素分泌,发现Munc13-1缺失选择性抑制葡萄糖诱导的第二相分泌,直接证明了LDCV的成熟过程是第二相胰岛素分泌的限速步骤。4)第二相分泌的产生或增强,需要代谢信号,而非膜去极化信号(通过KATP通道的关闭产生)的参与,然而具体参与的有哪些代谢信号还有待研究。我们对DAG接合能力缺失的Munc13-1H567K KI小鼠的研究表明葡萄糖诱导的DAG信号通路参与了胰岛素分泌的调控,Munc13-1是DAG/佛波醇通路一个关键的靶标分子。PMA能易化小鼠胰岛素的分泌,但KI小鼠中没有此效应,表明PKC不参与小鼠胰岛素分泌的调控,或作用于Munc13-1的上游。