重要粉蚧入侵种及其近似种的快速鉴定技术研究

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粉蚧类昆虫是属于半翅目Hemiptera、粉蚧科Pseudococcidae的植食性昆虫,其中有部分种在我国是重要的检疫性物种。由于粉蚧类昆虫具有形态学特征相似、种间亲缘关系复杂加之截获标本破损以及口岸鉴定能力参差不齐等难题,使其鉴定难度极大。因此,开发基于分子生物学的鉴定方法至关重要。本研究重点关注截获数量大,对我国农业生态环境及经济效益有重大影响的6属9种检疫性粉蚧,使用二代测序技术,对其中5种未测序的粉蚧完成高通量低丰度测序和基因组组装,利用生物信息学方法预测了粉蚧昆虫的种间特异性序列及特异性SSR(Simple Sequence Repeats)位点,筛选和验证了可用于分子鉴定的特异性引物,应用于检疫性粉蚧的快速鉴定,开发试剂盒,最大程度的提升检测检疫性粉蚧的速度和质量,为国门检疫提供了重要的技术支撑。主要研究结果如下:1、3属5种粉蚧的基因组测序和分析对进境检疫性的3属5种粉蚧包括刺粉蚧属(Planococcus):大洋臀纹粉蚧(P.minor)、南洋臀纹粉蚧(P.lilacinus);灰粉蚧属(Dysmicoccus):新菠萝灰粉蚧(D.neobrevipes)、菠萝灰粉蚧(D.brevipes);绵粉蚧属(Phenacoccus):石蒜绵粉蚧(P.solani)。利用二代测序技术进行了低丰度基因组测序,组装获得的基因组大小分别为597 Mb、452 Mb、284 Mb、432 Mb、270 Mb。评估分析发现组装质量较好,可以满足后续分析的要求。同时,也下载了美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)上已发布的4种粉蚧:扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis)、木瓜粉蚧(Paracoccus marginatus)、双条拂粉蚧(Ferrisia virgate)和木槿曼粉蚧(Maconellicoccus hirsutus)的基因组数据,进行基因组的组装和分析。本论文即基于以上9种检疫性粉蚧的基因组数据展开分析。2、基于基因组特异性序列的检疫性粉蚧鉴定使用Perl脚本和Bowtie软件分析和筛选9种检疫性粉蚧的种间特异性序列。随后,针对所筛选的特异性序列设计了375对引物,选择康氏粉蚧(Pseudococcus comstocki)和柑橘臀纹粉蚧(Planococcus Citri)作为阴性对照。分子鉴定实验发现,16对引物的PCR结果条带明显,物种特异性强,能够有效地区分出8种粉蚧,适用于入境粉蚧的分子鉴定工作。3、基于基因组特异性SSR序列的检疫性粉蚧鉴定针对上述9种粉蚧的基因组,使用MISA软件,挖掘出每个物种的SSR序列,筛选物种特异性SSR序列。随后,参考SSR序列所在的基因片段设计了156对引物,对包括康氏粉蚧(Ps.comstocki)、柑橘臀纹粉蚧(Pl.citri)在内的11种粉蚧DNA进行PCR扩增和电泳实验,共筛选出7对特异性引物,可有效区分11种粉蚧中的4种,证明了SSR在粉蚧昆虫的鉴定中具有一定实用性。本研究充分利用粉蚧基因组特异性序列开展了分子鉴定技术,对粉蚧科的6属9种粉蚧进行有效的分类鉴定。建立了一种更可靠、更快速、低成本的分子鉴定方法,可用于检疫性粉蚧的鉴定,为口岸进境水果的快速通关提供更高效的鉴定技术,为丰富粉蚧科物种的分类研究提供了重要参考。
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