丝腺是家蚕体内一对具有蛋白分泌功能的管状器官,根据其形态学特征和蛋白合成能力的不同可以分为前部、中部和后部丝腺。长久以来,研究人员一直希望通过加深对丝腺的了解以提高蚕丝产量,改良蚕丝品质。目前的研究表明,丝腺器官主要从两个方面影响蚕丝产量:丝腺细胞的蛋白合成效率和丝腺的细胞数量。丝腺的细胞数量是在胚胎期丝腺的发育过程中所决定的,但目前控制这一过程的分子机制尚不清楚。值得注意的是,不同产丝量家蚕的丝腺细胞数目有着较大的差异,丝腺细胞数目与产丝量呈现正相关的关系。这说明通过控制丝腺细胞数量进而提高蚕丝产量是有可行性的。本研究根据本实验室之前所鉴定到的一个bHLH 转录因子Bmsage,采用免疫荧光、RT-PCR、Western blot、CRISPR/Cas9、RNAi 等多种分子生物学技术,研究家蚕Bmsage在胚胎期丝腺发育过程中的功能。同时,采用ChIP-seq对Bmsage的靶基因进行鉴定,并在个体水平对所鉴定到的基因进行验证。获得的主要研究结果如下:1.Bmsage在胚胎期的表达及定位为确认Bmsage是否参与胚胎丝腺发育,首先调查了胚胎期丝腺发育过程中Bmsage的表达模式。RT-PCR和RT-qPCR的结果显示Bmsage在胚胎第3-5天开始低量表达,到第7天表达水平逐渐升高,第9天达到最高。同时Western blot也从蛋白水平得到了相同的结果。同时,对不同发育时期的胚胎进行免疫荧光染色。抗体染色结果显示Bmsage在胚胎期的丝腺中持续特异表达。这些结果确认Bmsage参与到了胚胎期丝腺的整个发育过程中。2.Bmsage的RNAi及敲除为确认Bmsage在胚胎期丝腺发育过程中的功能,利用RNAi技术在胚胎期对其进行敲低。首先以Bmsage全长cDNA为模板合成了 dsRNA,在蚕卵产下的2h内进行显微注射,同时注射EGFP dsRNA作为对照。在dsRNA注射后检测Bmsage的表达量,RT-qPCR的结果显示此时Bmsage被显著下调,这表明干涉取得了成功。解剖观察3龄第1天Bmsage-RNAi个体的丝腺,长度测量结果显示Bmsage-RNAi个体的丝腺显著短于对照。同时,对Bmsage-RNAi丝腺的细胞数目进行调查,统计结果显示Bmsage-RNAi个体的PSG细胞数量显著低于对照,但MSG细胞数与对照相比没有显著差异。这说明Bmsage敲低后影响了 PSG的细胞数量。为了更加深入的研究Bmsage对丝腺发育的影响,利用CRISPR/Cas9对其进行敲除。观察发现Bmsage敲除个体MSG的Z字型特征完全消失,且整个丝腺的细胞数进一步降低。这说明Bmsage不仅能够影响PSG细胞数也能够影响MSG的细胞数。通过RNAi和敲除两种方法不同程度的降低Bmsage表达量,丝腺细胞数量也不同程度的降低,这进一步确认了Bmsage参与控制丝腺细胞数目。3.Bmsage-RNAi个体经济性状的调查及不同品系的比较调查Bmsage-RNAi个体5龄期的丝腺形态及经济性状,发现Bmsage-RNAi个体在5龄时其丝腺依然短于对照,且PSG出现了异常的扭曲。进一步观察这种丝腺管腔扭曲是因为丝腺细胞的缺失所造成的。统计茧层率结果显示Bmsage-RNAi个体的茧层率显著低于对照。对5龄3天丝蛋白基因的表达情况进行调查,RT-qPCR的结果显示Bmsage-RNAi个体中丝素重链蛋白基因的表达量显著降低。值得注意的是,在调查5龄3天Bmsage的表达量时,发现无论在MSG还是PSG中Bmsage都已恢复到了正常的表达水平。这说明在5龄所看到的这些表型都是在胚胎期干涉Bmsage所造成的,并且在后天的发育中即使Bmsage的表达量恢复正常这些表型也不能被恢复。这些结果证明Bmsage能够在胚胎期通过控制丝腺细胞数目对家蚕经济性状产生巨大的、不可逆的影响。自然界中不同品系家蚕的丝腺细胞数目有着天然的差异,选择高丝量品系钟晔和低丝量品系大造进行对比。对比结果显示钟晔的丝腺细胞数显著高于大造。同时,RT-qPCR结果也显示胚胎期Bmsage在钟晔中的表达量也显著高于大造。这说明胚胎期Bmsage的表达量差异是造成不同品系家蚕丝腺细胞数目差异的原因,而这很可能是人工选择进化的结果。4.Bmsage的作用机制调查及其靶基因的鉴定果蝇中Dmsage通过抑制凋亡基因reaper进而控制唾液腺的细胞数量,但调查发现家蚕基因组中并没有reaper的同源基因。检测细胞自噬和细胞凋亡通路上的其他关键基因,RT-qPCR结果显示这些基因的表达量在Bmsage-RNAi个体和对照之间并没有显著差异。这一结果说明果蝇Dmsage和家蚕Bmsage可能通过不同的方式发挥作用。胚胎期丝腺发育主要是通过有丝分裂增加细胞数目的过程,RT-qPCR的结果显示Bmsage-RNAi个体中CyclinB和CyclinB3都被显著下调,这与前人文献报道的结果所一致。这些结果说明家蚕Bmsage可能通过细胞周期通路控制丝腺细胞数目。为寻找Bmsage的直接靶基因,以胚胎第6天的蚕卵为材料进行了 ChIP-seq。通过对测序结果的数据分析,最终鉴定到20个潜在的Bmsage靶基因。这些基因包括一些具有DNA结合能力的转录因子、能量代谢相关的酶、转运蛋白和几个组蛋白。根据基因注释选择了BGIBMGA004169、BGIBMGA009099、BGIBMGA008226、BGIBMGA012180 和BGIBMGA012203进行验证。首先调查了这些基因在胚胎期的表达情况,确认它们都在胚胎期表达之后,进行个体水平的验证。实验结果显示BGIBMGA004169、BGIBMGA008226和BGIBMGA012180这3个基因干涉个体的丝腺均出现了不同程度的异常。这说明这3个基因都参与到胚胎期丝腺的发育过程中,它们均是Bmsage的真实靶基因。以上这些结果首先证实ChIP-seq所得到的数据是可靠的,此外也说明Bmsage是通过控制多个下游基因进而控制丝腺的发育。5.Bmsage对Dfd的调控模式在ChIP-seq所得到的数据中,有一个Hox结构域的基因Dfd,选择Dfd进行更深入的研究。首先调查Dfd和Bmsage在胚胎期的表达模式,RT-qPCR结果显示Dfd和Bmsage呈现出一种完全相反的表达趋势,这暗示它们之间可能存在一种负调控的关系。分析ChIP-seq所获取的Dfd启动子序列,对其进行结合位点预测,发现这段序列中只有一个Bmsage的结合位点。采用EMSA验证该位点时,结果却显示Bmsage并不能结合该位点。因目前有多篇文献报道Bmsage需要借助SGF1才能结合到DNA序列上,再次分析这段启动子序列,发现其中存在2个SGF1的结合位点。EMSA的结果显示SGF1只能够结合在FKh-1位点。为了弄清Bmsage、SGF1和Dfd的关系,表达并纯化了带有GST标签的Bmsage重组蛋白,再次进行EMSA。EMSA结果显示SGF1可以结合在Dfd启动子上的FKh-1位点,在这过程中逐渐加入纯化的GST-Bmsage蛋白时,SGF1与FKh-1的结合条带会逐渐变淡。这一结果说明Bmsage可以将SGF1从FKh-1位点上竞争下来。构建Dfd启动子的双荧光素酶活测定载体,Bmsage和SGF1的真核表达载体,共同转染BmE细胞后进行酶活的测定。双荧光素酶活测定结果显示Bmsage可以抑制Dfd启动子的活性;而SGF1则能增强Dfd启动子活性;当同时表达Bmsage和SGF1时,Dfd启动子活性又被还原。基于以上的这些结果得出如下的调控模型:当SGF1表达时,SGF1可以结合在Dfd启动子上的FKh-1位点,此时Dfd启动子活性被上调;当Bmsage表达时,Bmsage可以结合SGF1,将其从FKh-1位点上竞争下来,此时Dfd的活性被抑制。此外,还分析了 ChIP-seq所鉴定到的所有靶基因的启动子序列,对其中Bmsage和SGF1的结合位点进行预测并统计。统计结果显示,这些基因的启动子区域几乎都存在多个SGF1的结合位点,而很少有Bmsage的结合位点。这暗示Bmsage借助SGF1调控其下游基因的这种调控模式是其在胚胎发挥功能的主要方式。6.Dfd的RNAi及表型调查采用RNAi技术在胚胎期对Dfd进行敲低,孵化并饲养Dfd-RNAi的家蚕,在3龄时解剖并观察丝腺。实验结果显示Dfd-RNAi PSG中密集的小弯相比于对照减少了约50%,只留下几个较大的弯曲部分,这让PSG看起来更像MSG。丝腺细胞数目的统计结果显示Dfd-RNAi MSG的细胞数目和细胞总数都显著低于对照。此外,调查还发现Dfd-RNAi个体胚胎中CyclinB的表达量显著低于对照,这与Bmsage干涉后相一致,说明Bmsage和Dfd都是通过细胞周期通路调控丝腺细胞数目。观察5龄期Dfd-RNAi丝腺时还发现此时丝蛋白基因在丝腺中的区域特异化表达被打破,即MSG开始表达丝素蛋白基因,而PSG开始表达丝胶蛋白基因。这一系列结果说明Dfd不仅参与到了胚胎期丝腺细胞数目决定的过程中,还参与到了胚胎期丝腺细胞的分化过程中。这些研究结果为进一步阐明丝腺发育的机制提供了新的线索。