【摘 要】
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水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）是一种植物病原细菌,它引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的病害之一;南方根结线虫（Meloidogyne incognita）是我国危害最为严重的植物寄生线虫;长期以来,两种植物病原的防治主要依靠有毒有害的化学农药,近年来,环境友好型生物防治受到越来越多的关注;由于活菌剂在施用过程中的不稳定性,菌株天然产物的研发成为热点。本研究从
【基金项目】
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国家重点基础研究发展计划（973）项目“作物高产高效的土壤微生物区系特征及其调控（项目编号2015CB150500）”；
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水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）是一种植物病原细菌,它引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的病害之一;南方根结线虫（Meloidogyne incognita）是我国危害最为严重的植物寄生线虫;长期以来,两种植物病原的防治主要依靠有毒有害的化学农药,近年来,环境友好型生物防治受到越来越多的关注;由于活菌剂在施用过程中的不稳定性,菌株天然产物的研发成为热点。本研究从深海独岛枝芽胞杆菌（Virgibacillus dokdonensis）MCCC 1A00493次级代谢产物中分离鉴定了抗菌和杀线虫天然化合物,并对其抗菌和杀线虫机制进行了探讨。主要研究结果如下:（1）通过分离鉴定发现了两个抗菌杀线虫新功能活性物质以生物活性测定为示踪,我们通过正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析Sephedax LH-20凝胶柱层析和半制备氨基色谱柱层析,从枝芽胞杆菌1A00493发酵液中分离纯化得到了具有抗水稻黄单胞菌活性的天然产物,通过液相质谱联用、核磁共振、化学合成、圆二色谱鉴定,确定该抗菌化合物为1-脱氧-N-乙酰氨基葡萄糖（1-deoxy-N-acetylglucosamine）;通过正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析和两次半制备氨基色谱柱层析,从枝芽胞杆菌1A00493发酵液中分离纯化得到了具有杀根结线虫活性的天然产物,通过液相质谱联用、标品高效液相色谱并分析1A00493基因组,确定该杀线虫化合物为4-乙烯基苯酚（4-vinylphenol）。枝芽胞杆菌1A00493抗菌和杀线虫天然产物的分离和结构鉴定为后续研究抗菌机制和杀线虫机制奠定了基础。（2）研究了1-脱氧-N-乙酰氨基葡萄糖抗菌新特性和作用机制测定了1-脱氧-N-乙酰氨基葡萄糖对常见病原细菌和植物病原真菌的生物活性;发现该物质特异性拮抗水稻黄单胞菌,其最小抑菌浓度为23.90μg/mL。扫描电镜和透射电镜显示1-脱氧-N-乙酰氨基葡萄糖对水稻黄单胞菌结构没有明显的影响。实时荧光定量PCR检测水稻黄单胞菌毒力、细胞分裂相关基因表达下调,而细胞壁合成相关基因略微上调,同时,基于药效团的靶标预测（pharmmapper）分析细胞分裂相关的蛋白为1-脱氧-N-乙酰氨基葡萄糖潜在作用靶标。（3）发现了4-乙烯基苯酚作用线虫的多种模式抑菌实验发现4-乙烯基苯酚对常见病原细菌和植物病原真菌均没有抗菌活性。线虫生测实验发现4-乙烯苯酚对模式秀丽隐杆线虫、植物病原南方根结线虫和动物病原捻转血矛线虫都具有杀线虫活性,4-乙烯基苯酚对秀丽隐杆线虫半数致死浓度为103.33μg/mL（48 h）和70.30μg/mL（72 h）,对根结线虫半数致死浓度为15.04μg/mL（48 h）和13.17μg/mL（72 h）。4-乙烯基苯酚能够抑制根结线虫卵孵化,4-乙烯基苯酚高浓度下对根结线虫具有趋避作用而低浓度下具有引诱作用,光学显微镜观察发现4-乙烯基苯酚处理线虫引起线虫肠道组织结构紊乱。（4）揭示了4-乙烯基苯酚触杀线虫的新机制通过idTarget和pharmmapper反向分子对接方法,推测4-乙烯基苯酚作用秀丽隐杆线虫的靶标涉及CLP-1介导的细胞坏死途径、凋亡蛋白介导的细胞凋亡途径和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）介导的免疫信号途径。通过转录组学验证发现4-乙烯基苯酚处理引起宿主线虫免疫应答,与异物质耐受和脱毒相关的基因显著富集。通过碘化丙啶染色荧光显微镜观察验证发现4-乙烯基苯酚处理破坏秀丽隐杆线虫肠道细胞细胞膜完整性,诱导线虫肠道细胞发生坏死性细胞死亡。通过吖啶橙染色荧光显微镜观察验证发现4-乙烯基苯酚诱导线虫肠道细胞发生大量的凋亡。通过线虫突变体生测初步确定线虫细胞坏死关键调控蛋白CLP-1和细胞凋亡关键调控蛋白EGL-1为4-乙烯基苯酚作用靶标。发现4-乙烯基苯酚触杀线虫同时具备三种机制:抑制天然免疫,诱导细胞凋亡和细胞坏死。
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