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天然免疫是宿主抵御病原微生物入侵的第一道防线,其中Ⅰ型干扰素(IFN-α、IFN-β等)在抗病毒过程中扮演着重要作用。当病毒入侵到宿主细胞后,病毒的病原相关分子模式(PAMPs)将被宿主细胞的模式识别受体(PRRs)识别,进而活化下游信号分子,诱导机体产生Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)并分泌到细胞外。分泌的IFN-α/β将与细胞表面的异源二聚体受体(IFNAR1和IFNAR2)结合,激活胞内两个酪氨酸激酶(JAK1、TYK2)。活化的酪氨酸激酶使下游两个信号转导和转录活化因子(STAT1、STAT2)发生磷酸化,进而形成异源二聚体,然后与干扰素调节因子9(IRF9)形成干扰素刺激基因因子3(ISGF3)。ISGF3转入细胞核后,结合到干扰素刺激应答元件(ISREs)上,从而诱导数以百计的干扰素刺激基因(ISGs)的转录、翻译,最终为宿主建立起抗病毒状态。猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的免疫抑制性疾病,给全球养猪业造成了极大的经济损失。已有研究表明,PRRSV进化出一系列逃避宿主免疫的机制,能通过多种策略拮抗Ⅰ型干扰素的产生。PRRSV编码蛋白nsp1α/1β、nsp2、nsp4、nsp11和N蛋白均能够抑制干扰素的产生。同时,PRRSV也可以抑制Ⅰ型干扰素信号转导,目前只有nsp1β和N蛋白有相关文献报道,然而对其他PRRSV编码蛋白抑制Ⅰ型干扰素信号通路的作用机制还不清楚。PRRSV nsp11具有套式病毒的特异性尿嘧啶核糖核酸内切酶(Nendo U)活性,在病毒复制过程中发挥着重要作用。本研究以PRRSV nsp11为研究对象,探究其在Ⅰ型干扰素信号通路中的作用,并解释其作用机制,主要研究内容如下:1.PRRSV nsp11及其核糖核酸内切酶活性缺失突变体抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活化和ISGs的表达为了探讨PRRSV nsp11是否具有抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活化和ISGs的表达的能力,我们将nsp11及其核糖核酸内切酶活性缺失突变体(H129A、H144A、K173A)真核表达质粒分别转染HEK-293T细胞,双荧光素酶报告系统和荧光定量PCR检测实验结果表明,nsp11及其突变体都可以抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活化和ISGs的表达。说明nsp11能够抑制Ⅰ型干扰素的信号转导,并且该抑制作用不依赖于nsp11的核糖核酸内切酶活性。为了进一步探究其可能的作用机制,将nsp11以及其突变体(H129A、H144A、K173A)真核表达质粒分别转染HEK-293T细胞,用IFN-α刺激6h。Western blot实验结果显示,PRRSV nsp11及其突变体不影响STAT1、STAT2的磷酸化,也不影响STAT1、STAT2和IRF9的表达。然后将nsp11及其突变体(H129A、K173A)真核表达质粒分别转染HEK-293T细胞,用IFN-α刺激6h后,分别提取细胞质蛋白和细胞核蛋白样品。核质分离实验结果表明,nsp11及其突变体(H129A、K173A)能够抑制ISGF3复合体成分p-STAT1、p-STAT2和 IRF9的入核。2.PRRSV nsp11及其核糖核酸内切酶活性缺失突变体与IRF9存在相互作用STAT1、SATA2、和IRF9在Ⅰ型干扰素信号通路中扮演着重要角色,可以形成ISFG3复合体,入核后将起始ISGs的表达。为了探究nsp11如何抑制ISGF3复合体入核,我们通过免疫共沉淀实验检测nsp11是否与ISGF3主要成分(STAT1、STAT2和IRF9)存在相互作用。将nsp11或突变体(H129A、H144A和K173A)分别与STAT1、STAT2、IRF9真核表达质粒共转染HEK-293T细胞,免疫共沉淀实验结果表明,nsp11和突变体都能与IRF9发生相互作用。为了进一步鉴定nsp11与IRF9的互作结构域,首先构建了4个IRF9不同区域缺失的截短突变体。将nsp11或H129A真核表达质粒分别与IRF9不同区域缺失的截短突变体真核表达质粒共转染到HEK-293T细胞。免疫共沉淀实验结果表明,nsp11和及其突变体(H129A)与IRF9的IAD结构域存在相互作用。3.PRRSV nsp11及其核糖核酸内切酶活性缺失突变体抑制ISGF3诱导的ISRE启动子活化由于STAT2也与IRF9的IAD结构域存在相互作用,nsp11和STAT2很可能竞争性与IRF9结合。为探究nsp11是否抑制ISGF3复合体的形成,将nsp11或突变体(H129A)真核表达质粒分别与ISGF3关键分子(STAT1、STAT2和IRF9)的真核表达质粒共转染到HEK-293T细胞,用IFN-α刺激6h。免疫共沉淀实验结果表明,PRRSV nsp11及其突变体(H129A)能够抑制IFN-α诱导的ISGF3形成。为探究nsp11抑制ISGF3形成的生物学效应,将nsp11、突变体(H129A、H144A和K173A)和ISGF3复合体(STAT1、STAT2和IRF9)真核表达质粒转染HEK-293T细胞,双荧光素酶报告系统检测结果表明,nsp11及其突变体(H129A、H144A和K173A)能显著地抑制ISGF3诱导的ISRE启动子活化。综上所述,本研究以PRRSV nsp11为研究对象,探讨其在拮抗Ⅰ型干扰素信号通路中的作用,发现PRRSV nsp11抑制ISRE启动子活化和ISGs的表达,然而其抑制ISRE启动子活化的能力不依赖于其内切核糖核酸酶活性,进一步研究表明PRRSV nsp11及其突变体与ISGF3重要成分IRF9的IAD区域互作,从而抑制ISGF3诱导的ISRE启动子活化。