目的将种子细胞接种至三维多孔支架上是构建组织工程骨的第一步,也是最重要的一步。但目前常用的接种方法所构建的组织工程细胞／支架复合体存在着种子细胞数量有限、细胞在支架上的分布不均以及支架血管化过程延期完成等三大缺点,极大的制约了骨组织工程技术的发展。因此有必要改良现有的骨组织工程接种方法以提高细胞的接种效率、促进种子细胞在支架上的均匀分布以及提高支架在体内的矿化和血管化程度,使骨组织工程技术更有效地服务于临床需要。在本文第一部分研究中,我们构建了壳聚糖／β-磷酸三钙复合支架并对其生物相容性进行检测。在体内正常的骨愈合过程中,干细胞会通过血液循环源源不断的迁移到创伤部位来补充凋亡损失的成骨细胞来保证骨修复过程的持续进行。而目前的组织工程技术均是一次接种细胞至支架材料上,不能有效模拟机体的骨创伤愈合过程。因此,在第二部分研究中,我们尝试运用多次接种构建细胞／支架复合体,并比较多次接种和单次接种法在细胞增殖分布和骨形成效果方面的差异。单纯依靠液体的渗透难以将种子细胞接种至支架内部,在第三部分研究中,我们创新性的改良了正压辅助动态接种法,并运用正压辅助动态接种和双面静态接种法将兔骨髓基质干细胞接种至壳聚糖／β-磷酸三钙复合支架材料上,并比较两种接种方法在细胞增殖和分布、支架的矿化和血管化程度方面的效果差异。方法1-骨组织工程复合支架的制备与生物相容性检测(1).冷冻干燥法制备壳聚糖／p-磷酸三钙复合支架。(2).全骨髓贴壁法提取、培养并鉴定骨髓基质干细胞。(3).扫描电镜检测CS/β-TCP复合支架孔径大小。(4).阿基米德法计算CS/β-TCP复合支架孔隙率。(5).CCK-8试剂盒检测不同浓度的CS/β-TCP支架材料浸提液对MSCs活性的影响。(6).丫啶橙染色、荧光显微镜观察试培养MSCs在CS/β-TCP支架上的生存状态。2.多次与单次接种法所制备的组织工程骨在细胞增殖、分布及体内新骨量等方面的比较(1).将7.2×105MSCs分三次、二次、一次接种至CS/β-TCP复合支架上,分为三次组(Group 3T)、二次组(Group 2T)和一次组(Group 1T)。接种1小时后计算各组MSCs的初始接种率。(2).接种24小时后行成骨定向诱导,于诱导后第3,5,8和12天用CCK-8试剂盒检测各组MSCs活性并绘制细胞增殖活性曲线图。(3).成骨诱导后0、7、14、21和28天检测各组细胞／支架复合体上的总DNA和总蛋白含量,并检测碱性磷酸酶活性大小,绘制总DNA含量曲线图和ALP活性曲线图。(4).为了验证多次和单次接种法对支架上的MSCs成骨分化能力影响与否,在成骨诱导后第0、7、14、21和28天行逆转录聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)技术检测各组细胞／支架复合体上成骨标志物骨钙蛋白,骨粘连蛋白和骨桥蛋白的基因表达水平。(5).在成骨诱导后0、14和28天,对各组细胞／支架复合体上的细胞行碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色,激光扫描共聚焦显微镜观察支架中心区域细胞数量和分布均匀程度。(6).制备兔下颌骨缺损模型,将各组细胞／支架复合体植入缺损处。分别于术后8和16周处死动物,取缺损部位标本行X线和Masson染色观察各组下颌骨缺损修复和改建情况。3.正压辅助动态接种与双面静态接种法所制备的组织工程骨在细胞增殖、分布及血管形成效果方面的比较(1).注射器活塞正压抽吸10,20,40和60次分别将7.85×105MSCs接种至CS/β-TCP复合支架上,对照组支架则从双侧表面滴加相同数量细胞,在接种后1小时计算各组MSCs的初始接种率。同时,为了验证注射器活塞产生的压力对MSCs活性的影响与否,在接种后0,3,5,8和12天用CCK-8试剂盒检测各组MSCs活性并绘制细胞增殖活性曲线图。(2).在接种后0、7和14天,对各组细胞／支架复合体上的细胞行PI染色,激光扫描共聚焦显微镜观察在体外培养条件下支架中心区域的MSCs数量和分布均匀程度。(3).将各组细胞／支架复合体植入裸鼠背部皮下,分别于术后2,4和6周取出细胞／支架复合体行冰冻切片。DAPI染色,荧光显微镜观察在体内培养条件下正压辅助接种法对支架内部细胞的增殖和分布的影响。(5). Voncossa染色检测正压辅助接种法对细胞／支架复合体异位成骨的影响。(6).CD31免疫荧光染色检测正压辅助接种法对细胞／支架复合体血管化的影响。结果(1).冷冻干燥法制备的CS/β-TCP比例4：2.7的复合支架,其孔径范围为80μm-130gm左右；其孔隙率为(87.5±4.1)%；各种浓度的复合支架材料浸提液对细胞无毒性；将骨髓基质干细胞接种至支架上试培养一周后发现细胞／材料复合体上细胞生长状态良好。另外,提取培养的兔骨髓细胞能在定向诱导下向成骨、成软骨和成脂方向分化且具有成纤维细胞集落形成单位,为骨髓基质干细胞。(2).三次接种法的初始接种率能达到81.9%±0.03%,大于二次接种法的71.5%±0.02%和一次接种法的60.3%±0.06%。WST-8结果显示三次组的细胞活性在第3、5天里低于、但是到第8天高于一次和二次组。这种趋势一直持续到第12天。除了第12天外,二次组MSCs/CS/β-TCP复合体上的MSCs的活性在整个培养期间均高于一次组。总DNA含量显示一次组的细胞总DNA含量在成骨诱导0天较二次和三次组高,到成骨诱导7天时,二次组的细胞数量等于一次组,略大于三次组。到成骨诱导第14和21天时,二次组细胞数远大于一次组和三次组。到成骨诱导28天时,三次组细胞数明显大于二次和一次组。通过共聚焦显微镜观察细胞在支架内部的数量和分布情况,一次组细胞数量、细胞分布均匀程度在成骨诱导0天时均大于二次组和三次组。到成骨诱导第14天时,二次组和三次组的细胞数量大于一次组。而二次和三次组支架上细胞分布均匀程度大于一次组并一直持续。到成骨诱导第28天,三次组的细胞数量开始大于二次组。RT-PCR技术来检测MSCs/CS/β-TCP复合体上OC,ON和OP的表达,来验证单次和多次接种法是否会影响MSCs成骨分化能力。在整个培养期间,三次组和二次组支架上的MSCs的OC,ON和OP表达量均大于一次组。X线片显示三次组和二次组缺损处骨密度在术后8、16周均大于一次组。Masson染色结果显示三次组新骨形成和改建速度最快,二次组其次,一次组最慢。(3).静态双面接种法初始接种率为79.42±9.87%；10次的正压抽吸组接种效率较双面组低,为53.74±9.96%；随着正负压抽吸次数的增加,初始接种率也不断提高。20次的正压抽吸接种能达到92.63%±3.17%接种率,接种效率明显大于双面组；而40次和60次的正负压抽吸更是分别达到了95.26±4.78%,和97.14%士1.30%的初始接种效率。但是CCK-8细胞活性结果显示40次和60次的正压抽吸极大的影响细胞活性。20次组能同时达到一个相对较高的初始接种率和细胞活性,因此正压辅助接种法的抽吸次数在后续试验均选择20次的正压抽吸。共聚焦显微镜观察结果显示正压辅助抽吸20次组无论是在细胞数量还是在细胞分布均匀程度方面均要优于双面组。把各组细胞／支架复合体植入裸鼠体内2,4和6周后,荧光显微镜观察到正压辅助组在细胞数量和分布均匀程度方面均高于双面组。Voncossa染色结果显示正压辅助组在支架异位矿化程度均高于双面组和对照组。CD31免疫荧光染色显示正压辅助组在支架程度方面均高于双面组和对照组。结论(1).本实验所制备的CS/β-TCP复合支架具备合适的孔径和孔隙率,良好的生物相容性和亲水性良好,满足骨组织工程支架要求。(2).相比单次接种法,多次接种法有以下几点优势：(1).提高细胞初始接种率；(2).促进细胞增殖；(3).提高细胞在支架材料上的分布均匀程度；(4).促进材料吸收；(5).促进骨形成和骨改建。(3).本实验研究所改进的正压辅助接种法能提高种子细胞的接种效率；促进种子细胞的增值；提高细胞在支架上的均匀分布程度；促进支架在体内的异位矿化；促进支架内部的血管新生,为骨组织工程实验研究提供了一种简易、高效的动态接种方法。