蛇毒活性蛋白Natrin与双相生物陶瓷BCP协同促进成骨作用的研究

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目的:通过体内和体外实验研究生物活性因子广西眼镜蛇毒活性蛋白Natrin和具有骨诱导性的双相生物陶瓷(BCP)对大鼠成骨的影响,探讨活性因子与活性陶瓷材料协同促进成骨的作用,为临床修复大面积颅骨缺损提供依据。方法:(1)考察单独Natrin蛋白对成骨细胞的作用:体外培养3-7天SD乳鼠原代成骨细胞,用不同浓度的蛋白Natrin(0g/ml,2.5g/ml,5g/ml和10g/ml)干预,分别于2,5,8天测定MTT,ALP活性和成骨相关基因(BMP2, RUNX2,ALP,BSP,OCN,COL1A1)表达,并行FDA/PI、鬼笔环肽、一型胶原、ALP和茜素红染色;(2)考察Natrin蛋白及BCP活性陶瓷对成骨细胞作用的体外实验:将原代成骨细胞种植在多孔HA/β-TCP双相生物陶瓷(BCP,质量比6:4,直径12mm,厚度2mm,孔隙率>75%)材料上,然后用不同浓度的蛋白Natrin(0g/ml,1.25g/ml,2.5g/ml和5g/ml)干预,分别于2,5,8天检测MTT,ALP活性和成骨相关基因(BMP2,RUNX2,ALP,BSP,OCN,COL1A1)表达,并行FDA/PI、鬼笔环肽染色和扫描电镜;(3)Natrin蛋白及BCP活性陶瓷用于颅骨缺损修复的动物实验:将成年雄性SD大鼠40只(体重300±20g)随机分配成四组(A, B, C, D组,每组10只),建立矢状缝与人字缝十字交叉右上象限5mm直径圆形颅骨缺损模型,A、B组为不加材料的空白组,C、D组植入双相生物陶瓷(BCP,质量比6:4,直径5mm,厚度2mm,孔隙率>75%)材料,抗炎3天后,A、C组注射等量生理盐水,B、D组于颅骨缺损局部注射Natrin蛋白浓度为5g/ml、2.5g/ml的生理盐水0.5ml,于术后1个月、2个月每组分别处死5只大鼠,行大体观察、硬组织切片,锥束CT扫描。结果:(1)考察单独Natrin蛋白对成骨细胞的作用:在二维培养中,MTT、ALP活性与成骨相关基因表达的检测等结果表明单独Natrin对成骨细胞的增殖和分化具有促进作用,其最适作用浓度为5g/ml;(2)考察Natrin蛋白及BCP活性陶瓷对成骨细胞作用的体外实验:在三维培养中,MTT、扫描电镜、ALP活性与成骨相关基因表达的检测等结果表明Natrin和BCP陶瓷对成骨细胞的增殖和分化具有协同促进作用,尤其是在Natrin蛋白为2.5g/ml时作用最为明显;(3)Natrin蛋白及BCP活性陶瓷用于颅骨缺损修复的动物实验:大体观察、锥束CT扫描和硬组织切片等检测看出BCP有良好的生物相容性,可促进颅骨缺损修复,添加蛋白Natrin后促进效果更为明显。结论:Natrin蛋白及BCP活性陶瓷可协同促进颅骨缺损修复,具有较好的临床开发价值。
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