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【目的】
1.斑马鱼脑创伤模型的成功构建及其评价。
2.通过临床常用药物胞磷胆碱的初步评估，探索此模型在创伤性脑部炎症的药物筛选与开发中的运用。
【方法】
1.利用转基因斑马鱼coro1a:EGFP构建创伤性脑损伤模型及其生存曲线分析。
2.利用共聚焦显微镜实时观察小胶质细胞的行为变化：分别于创伤后1h、12h、24h、48h在有无胞磷胆碱药浴作用下观察创伤部位周围小胶质细胞的聚集与扩散情况。
3.采用整体胚胎原位杂交技术检测创伤后1h、6h、12h、24h在有无胞磷胆碱药浴作用下创伤部位周围的il-1β、il-6、il-4和il-10的mRNA表达水平。
4.采用qRT-PCR法检测创伤后1h、12h、24h、48h有无药浴处理在创伤部位周围的il-1β、il-6、il-4和il-10的mRNA表达水平。
5.通过TUNEL检测法检测创伤后1h、6h、12h有无胞磷胆碱药浴处理在创伤部位周围的神经类细胞凋亡情况。
6.利用BrdU检测创伤和创伤后药浴1h创伤部位周围的神经类细胞增殖修复情况。
【结果】
本次实验通过针刺3dpf斑马鱼胚胎后脑这种方式构建脑创伤模型。与未创伤组比较，创伤组的幼鱼生存率没有受到影响(P＞0.05)。通过共聚焦显微镜观察EGFP标记的小胶质细胞转基因斑马鱼，结果发现在创伤后可发生小胶质细胞快速在创伤周围聚集的现象，且这种聚集在1h达到高峰，此后随着创伤时间的延长，集聚又逐渐扩散消失。后期用胞磷胆碱探究此次模型的应用性，研究发现在创伤后1h时，与单纯创伤组对比，创伤+胞磷胆碱组可显著促进(P＜0.05)小胶质细胞激活和聚集在创伤部位周围。随着创伤时间的延长，小胶质细胞集聚逐渐扩散消退。与小胶质细胞的变化一致，炎症因子的变化总体上呈时间依赖性，即创伤+胞磷胆碱组中的促炎症因子il-1β和il-6以及抗炎症因子il-4和il-10的mRNA表达水平在脑创伤1h后显著升高，随后又逐渐下降。此外，我们还发现胞磷胆碱能够减少脑部神经类细胞凋亡并促进其增殖修复。
【结论】
1.以胞磷胆碱为代表的炎症治疗药物，可能明显地增强脑创伤动物模型中不同炎症因子的表达及可能促进脑部神经类细胞的修复。
2.本实验成功构建了斑马鱼创伤性脑损伤模型，且该模型可应用于炎症药物及神经保护性药物的初步筛选。
1.斑马鱼脑创伤模型的成功构建及其评价。
2.通过临床常用药物胞磷胆碱的初步评估，探索此模型在创伤性脑部炎症的药物筛选与开发中的运用。
【方法】
1.利用转基因斑马鱼coro1a:EGFP构建创伤性脑损伤模型及其生存曲线分析。
2.利用共聚焦显微镜实时观察小胶质细胞的行为变化：分别于创伤后1h、12h、24h、48h在有无胞磷胆碱药浴作用下观察创伤部位周围小胶质细胞的聚集与扩散情况。
3.采用整体胚胎原位杂交技术检测创伤后1h、6h、12h、24h在有无胞磷胆碱药浴作用下创伤部位周围的il-1β、il-6、il-4和il-10的mRNA表达水平。
4.采用qRT-PCR法检测创伤后1h、12h、24h、48h有无药浴处理在创伤部位周围的il-1β、il-6、il-4和il-10的mRNA表达水平。
5.通过TUNEL检测法检测创伤后1h、6h、12h有无胞磷胆碱药浴处理在创伤部位周围的神经类细胞凋亡情况。
6.利用BrdU检测创伤和创伤后药浴1h创伤部位周围的神经类细胞增殖修复情况。
【结果】
本次实验通过针刺3dpf斑马鱼胚胎后脑这种方式构建脑创伤模型。与未创伤组比较，创伤组的幼鱼生存率没有受到影响(P＞0.05)。通过共聚焦显微镜观察EGFP标记的小胶质细胞转基因斑马鱼，结果发现在创伤后可发生小胶质细胞快速在创伤周围聚集的现象，且这种聚集在1h达到高峰，此后随着创伤时间的延长，集聚又逐渐扩散消失。后期用胞磷胆碱探究此次模型的应用性，研究发现在创伤后1h时，与单纯创伤组对比，创伤+胞磷胆碱组可显著促进(P＜0.05)小胶质细胞激活和聚集在创伤部位周围。随着创伤时间的延长，小胶质细胞集聚逐渐扩散消退。与小胶质细胞的变化一致，炎症因子的变化总体上呈时间依赖性，即创伤+胞磷胆碱组中的促炎症因子il-1β和il-6以及抗炎症因子il-4和il-10的mRNA表达水平在脑创伤1h后显著升高，随后又逐渐下降。此外，我们还发现胞磷胆碱能够减少脑部神经类细胞凋亡并促进其增殖修复。
【结论】
1.以胞磷胆碱为代表的炎症治疗药物，可能明显地增强脑创伤动物模型中不同炎症因子的表达及可能促进脑部神经类细胞的修复。
2.本实验成功构建了斑马鱼创伤性脑损伤模型，且该模型可应用于炎症药物及神经保护性药物的初步筛选。