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研究背景：关节软骨缺损后其自身修复能力有限，导致结构和功能上不可逆的损害。目前，临床中治疗关节软骨缺损的方法有骨髓刺激修复和软骨移植修复，前者疗效随时间逐渐下降；后者材料来源受限，且异体组织具有免疫原性。随着生物医学工程的发展，自体软骨细胞因其功能相同、无免疫排斥反应，被用作组织工程软骨的种子细胞。但软骨细胞体外扩增能力有限，且取材局限较大。而间充质干细胞具有多向分化潜能，来源广泛，其中的骨髓间充质干细胞增殖能力强，可在体外大规模扩增而不丢失多向分化潜能，并且异体移植排斥反应小，有望成为组织工程软骨理想的种子细胞。hBMSCs向软骨细胞的分化需要特定的诱导环境，特别是需要一定的生长因子保证其迁移、增殖、存活及向软骨的分化潜能。目前，研究者已经发现部分信号分子具有调控骨髓间充质干细胞迁移、增殖(PDGF-B, FGF-2)和软骨分化(TGF-β1, TGF-β3，IGF-I)的作用。EMILIN3是EMILIN基因家族（EMILIN1、EMILIN2、EMILIN3)的成员，在NH2末端有半胱氨酸弹性蛋白微纤维富集区。研究发现：EMILIN3在软骨膜和发育的骨骼周围高表达，但是在成熟的成骨细胞几乎检测不到它的表达；在体外培养的人hMSCs向软骨诱导过程中，随着时间的延长EMILIN3表达增加，推测此基因在骨骼的中可能发挥着重要的作用。因此，本研究拟通过检测EMILIN3对hBMSCs增殖及向软骨分化的影响，为软骨修复提供新的依据。研究目的：1.通过构建EMILIN3腺病毒表达载体感染hBMSCs，研究EMILIN3过表达对hBMSCs增殖的影响。2.研究EMILIN3过表达对hBMSCs向软骨分化细胞分化的影响，以期为软骨修复提供新的依据。研究方法：1.采用密度梯度离心法分离、纯化。2.利用PCR方法扩增人EMILIN3基因，通过同源重组将目的基因插入腺病毒表达质粒，通过PCR进行阳性克隆鉴定，测序，利用Western blot检测EMILIN3蛋白表达。在大肠杆菌中扩增阳性质粒和腺病毒辅助质粒，然后在293T细胞中进行病毒包装。通过CsCl密度梯度离心进行病毒的分离、纯化，然后感染393T细胞测定病毒的滴度。3.将hBMSCs培养于96孔板，分别以10、50、100MOI病毒感染hBMSCs细胞，48h后普通荧光显微镜观察感染效果，选择感染效果最好的MOI进行后续实验。4.利用MTT方法检测EMILIN3蛋白表达对细胞的增殖情况。5.用实时定量PCR法检测EMILIN3蛋白表达对hBMSCs向软骨细胞诱导后CollagenII、Aggrecan、SOX9的基因表达水平。6.Western bloting检测EMILIN3蛋白表达对hBMSCs向软骨细胞诱导后CollagenII、Aggrecan、SOX9的蛋白表达水平。结果：1.经过密度梯度离心法获得的hBMSCs细胞纯度较高。2.利用PCR方法扩增EMILIN3基因得到2336bp片段，与预期大小相符。通过克隆鉴定和测序证明插入到腺病毒表达载体中的EMILIN3基因序列完全正确。Westernblot检测EMILIN3表达质粒在100KD左右有阳性条带，其大小和EMILIN3-GFP-Flag融合蛋白（114KD）相符。利用试剂盒测得对照腺病毒的滴度是5×1010IFU/ml，EMILIN3病毒的滴度是1.4×1011IFU/ml。。3.荧光显微镜下发现腺病毒在MOI=100时感染hBMSCs的效果最好。4.EMILIN3病毒感染hBMSCs后通过MTT实验显示：hBMSCs+对照腺病毒组细胞和hBMSCs组细胞相比增殖能力降低，但在所有的检测点均没有差异；在第1,2天，hBMSCs+EMILIN3腺病毒组细胞与hBMSCs+对照腺病毒组细胞、hBMSCs组细胞相比均没有差异。在第3,4，5和6天，hBMSCs+EMILIN3腺病毒组细胞OD值与hBMSCs+对照腺病毒组细胞相比均有差异（p<0.05）。在第4，5和6天，hBMSCs+EMILIN3腺病毒组细胞OD值与MSCs组细胞相比均有差异（p<0.05）。5.经过前期成软骨诱导后，各组细胞能检测到CollagenII、Aggrecan、SOX9mRNA的表达，说明诱导成功。EMILIN3过表达组细胞向软骨细胞诱导后与对照病毒细胞组相比CollagenII、Aggrecan、SOX9mRNA表达分别增加2.5倍、2.7倍、2.1倍，且差异显著，对照病毒细胞组和纯细胞组相比没有明显差异。6.经过前期成软骨诱导后，各组细胞能检测到CollagenII、Aggrecan、SOX9蛋白的表达，说明诱导成功。EMILIN3过表达组细胞向软骨细胞诱导后与对照病毒细胞组相比CollagenII、Aggrecan、SOX9蛋白相对表达分别增加0.75倍、0.74倍、0.40倍，且差异显著，对照病毒细胞组和纯细胞组相比没有明显差异。结论：1.通过密度梯度离心贴壁培养法分离出的hBMSCs细胞纯度高。2.通过PCR阳性克隆鉴定、测序、Western blot鉴定实验证明腺病毒构建成功。3.腺病毒在MOI=100时感染hBMSCs效果最好，后续实验按照此MOI值进行。4. EMILIN3基因表达对hBMSCs增殖有明显的促进作用。5. EMILIN3蛋白过表达后明显增强hBMSCs细胞向软骨细胞诱导分化，为后期进行软骨损伤修复提供了理论基础。