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防御素是一种存在于多种生物体内的小分子肽,在机体先天免疫系统中扮演着重要的角色。鸡体内有14种β-防御素且具有很强的抗细菌活性和广泛的抗菌谱,提示我们可以将其开发一种新的抗微生物制剂。因此,鸡防御素的成功获取能带来社会和经济效益。但鸡体内天然防御素表达量低,分离困难,合成成本高,为了获得大量活性Gal-5蛋白,故本研究选用基因串联技术表达鸡Gal-5重组蛋白。内容与结果所述如下:1.Gal-5基因序列的扩增及在大肠杆菌中的串联表达根据NCBI中鸡Gal-5的cDNA编码区序列(登录号:AY621307)和E.coli偏好性将Gal-5的成熟肽基因进行优化并将信号肽切除后经连接肽进行首尾串联得到2×串联体,并在序列中引入限制性内切酶NdeI、EcoRI酶切位点,设计引物用于扩增2×Gal-5成熟肽基因片段,将所得序列与表达载体Pet-28a经双酶切后构建重组表达载体Pet-28a-2×Gal-5,并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21用IPTG诱导表达,结果显示在IPTG浓度为0.5mM,20℃的条件下诱导12h得到表达,SDS-PAGE和Western Blot检测结果显示表达的含有His标签的重组蛋白大小约为15kDa,表明成熟肽序列2×Gal-5在大肠杆菌中表达成功,但主要以包涵体形式存在。2.Gal-5基因序列的扩增及在毕赤酵母中的串联表达根据NCBI中鸡Gal-5的cDNA编码区序列(登录号:AY621307)和Pichia pastoris偏好性将Gal-5的成熟肽基因进行优化并将信号肽切除后经连接肽进行首尾串联得到2×串联体,并在序列中引入限制性内切酶EcoRI、Not I酶切位点,设计引物用于扩增2×Gal-5成熟肽基因片段,将所得序列与表达载体pPIC9K经双酶切后构建重组表达载体pPIC9K-2×Gal-5,将鉴定正确的质粒用限制性内切酶SalⅠ线性化处理后电击转入毕赤酵母GS115用甲醇诱导表达,诱导表达上清用SDS-PAGE和Western Blot检测。结果显示在甲醇浓度为1%的条件下,30℃诱导72h后Gal-5在菌液上清中得到表达,SDS-PAGE和Western Blot检测结果显示在约12kDa的位置出现条带,与预期结果一致,表明成熟肽序列2×Gal-5在毕赤酵母中表达成功。