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凝乳是生产原制干酪的关键步骤,凝乳酶在此过程中发挥至关重要的作用。小牛皱胃酶(calf rennet)早在公元前约6世纪就被用于干酪制作中,是人类最早用于食品生产中的酶之一。世界干酪产量迅速增加和小牛宰杀量持续下降加剧了小牛皱胃酶供需紧张和高昂价格,此外宗教、饮食和食品法规等因素,使得寻求其替代物成为乳品领域研究热点之一。微生物蛋白酶,尤其是真菌来源的天冬氨酸蛋白酶是小牛皱胃酶的主要替代来源并已规模化生产,但细菌来源具有凝乳作用的蛋白酶研究较少。本文以西藏牦牛乳样品中筛选到的一株具有产凝乳酶潜力的细菌(BD3526)为研究对象,对其进行了鉴定和命名,以小麦麸皮为培养介质对其产酶条件进行优化,通过分离纯化及菌株全基因组测序,确定了该酶酶原的氨基酸序列及其编码基因,并对其酶学特性进行了研究。论文主要研究结果如下:(1)以微生物菌落在脱脂乳平板上形成沉淀圈和水解圈为指标,筛选出一株具有产凝乳酶潜力的菌株BD3526。该菌株在30 g/L的小麦麸皮中,30℃、180 r/min培养48h,发酵上清中的MCA为2422.09±68.35 SU/mL,PA为0.40±0.01 U/mL,MCA/PA比值为6655.22。在同等MCA条件下,BD3526凝乳酶和商业化Rhizomucor miehei凝乳酶的PA相当,但较小牛皱胃酶和重组凝乳酶略强,说明该菌株来源的凝乳酶在干酪制作中的应用潜力。经生理生化、16S rRNA、全细胞脂肪酸组成、G+C含量、DNA同源杂交和全基因组测序手段鉴定,发现BD3526为类芽孢杆菌属的一个新种,并命名为Paenibacillus bovis sp.nov.(CGMCC No.8333=DSM No.28815=ATCC No.00318)。(2)通过单因素和响应面实验优化了BD3526利用麸皮生产凝乳酶的发酵参数。摇瓶发酵时,温度、溶氧量和发酵时间3个因素对酶产量影响极其显著,在最佳发酵条件下(麸皮浓度:30 g/L,温度:30℃,250 mL锥形瓶装液量:30 mL,接种量:5%,摇床转速:300 r/min,发酵时间18 h),MCA最大值为6733.81±663.73 SU/mL。在7 L发酵罐中,随着搅拌速率(200、250、300和400 r/min)和通气量(3.5、4.5和5.5 L/min)的增加,上清中的MCA增加趋势明显;搅拌速率为400 r/min、通气量为5.5 L/min的条件下,流加500~800 mmol/L的H2O2可不同程度地提高上清中的酶活水平(流加2 s,间歇100 s,平均流速为2.5 mL/h),H2O2浓度为500 mmol/L时,MCA在24 h达到了最大值(14777.78±1099.94 SU/mL),此时MCA/PA比值也达到了最大值(32664.21±918.48)。(3)利用BD3526胞外多糖合成量与溶氧量呈正相关,且多糖具有先合成后消耗的特性,解决了多糖对目的蛋白沉淀的影响。经分离纯化,BD3526凝乳酶为表观相对分子量为35000的金属蛋白酶,活性中心含Zn2+,该酶具有自身水解失活的特性,Ca2+对其具有显著的保护作用;最适pH为7.0,MCA和PA的最适温度分别为65℃和60℃,经60℃热处理30 min可使其MCA完全灭活,60℃、10 min或55℃、20 min热处理可使其PA完全丧失,催化酪蛋白生成酪氨酸的米氏方程Km和Vmax分别为1.36 g/L和0.017μmol/min。较重组chymosin和R.miehei来源凝乳酶,该酶对β-CN水解能力较强,对αs和κ-CN的水解能力与前两者相当,对κ-CN的水解位点为Met106–Ala107,与chymosin不同(Phe105–Met106)。(4)利用肽指纹图谱和全基因组测序技术,确定了BD3526凝乳酶酶原编码基因和氨基酸序列。该酶酶原由1671 bp的zinc metalloproteinase precursor 1(zmp1)基因编码,由556个氨基酸残基组成。经N-端测序,成熟酶的N-端前15个氨基酸序列为ATGTGKGVLGDTKTF,其酶原His252–Ala253肽键发生水解后转变为成熟酶。通过氨基酸序列的同源比对,BD3526凝乳酶含有HEXXH和GXXNEXXSD两个保守序列,但与已知蛋白酶相似度均较低,是M4家族(Thermolysin-like proteinase,TLP)一个新成员;该酶在构成控制TLPs结构稳定的Ca3位点的氨基酸残基与比对TLPs存在显著不同,这是解释该酶稳定性差以及Ca2+对其稳定性具有显著影响的重要原因。根据构建的模型,BD3526凝乳酶与M4金属蛋白酶具有相似的空间结构并由两个大的结构域组成:N-端富含β-折叠,C-端则以α-螺旋为主,结合Zn2+的HEXXH活性中心呈α-螺旋并处于N-端β-折叠和C-端α-螺旋所形成的狭窄且较深的裂缝内。