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破骨细胞(osteoclast,OC)和成骨细胞(osteoblast,OB)组成了一对紧密协调的平衡机制,确保骨组织的健康。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子(RANKL)是促进破骨细胞分化和重吸收最主要的两种细胞因子。而骨保护素(osteoprotegerin,OPG),通过抑制破骨细胞的生成、活化和骨吸收能力增加骨密度。研究发现,破骨细胞的骨吸收过程与自噬密切相关,而自噬在OPG抑制破骨细胞骨吸收过程中的作用机制尚未阐明。本研究以BALB/c小鼠骨髓源巨噬细胞(BMMs)分化形成的破骨细胞为研究对象,自噬抑制剂CQ、激动剂RAP和OPG处理后,从OPG对破骨细胞自噬的影响,自噬在OPG调控破骨细胞骨吸收过程中的作用,及AKT/mTOR/ULK1在OPG调控破骨细胞自噬过程中的作用,三方面阐明AKT/mTOR/ULK1介导的自噬在OPG调控破骨细胞骨吸收活性中的作用机制。为临床应用OPG治疗骨代谢疾病提供理论依据。1.OPG对破骨细胞自噬的影响为了揭示OPG对破骨细胞自噬的影响,本研究通过添加不同浓度(0、20、40、80 ng/mL)的OPG处理细胞不同时间(0、3、6、12h),结合CQ和RAP,研究破骨细胞自噬小体及自噬流的变化,免疫荧光检测MDC和LC3荧光强度,透射电镜检测自噬小体数量。结果发现,40ng/mLOPG作用破骨细胞3h后,能够显著提高细胞的自噬水平。OPG可以减弱CQ对破骨细胞自噬的抑制作用,而RAP与OPG可以显著增强破骨细胞的自噬水平;OPG显著增强了 MDC和LC3荧光强度并提升了自噬小体数量,而CQ抑制了破骨细胞自噬溶酶体的降解,MDC和LC3荧光强度增强,自噬小体数量显著减少,添加RAP促进了破骨细胞的自噬,且OPG可以增强RAP对自噬的促进效果。说明,40ng/mLOPG对分化至3d的破骨细胞自噬流有显著的促进作用,并促进了破骨细胞内自噬小体的形成。2.自噬在OPG调控破骨细胞骨吸收中的作用为了阐明自噬在OPG调控破骨细胞骨吸收过程中的作用,本研究通过自噬抑制剂CQ、激动剂RAP处理破骨细胞,采用xCelligence系统实时监测细胞指数变化,骨吸收陷窝试验观察破骨细胞骨吸收能力变化,荧光定量PCR和Western blotting检测组织蛋白酶CathepsinK和抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP的基因转录和蛋白表达水平。结果发现,添加OPG和RAP处理80h均能显著抑制破骨细胞存活率,添加RAP组后期维持在较低水平;OPG和RAP处理组破骨细胞骨吸收能力较对照组显著下降,而CQ能够部分减弱OPG对破骨细胞骨吸收能力的抑制作用;RAP使CathepsinK和TRAP基因转录及蛋白表达水平显著升高,而CQ能够部分抵消OPG对CathepsinK和TRAP蛋白表达的抑制作用。说明OPG在增强破骨细胞自噬的同时显著降低了其骨重吸收能力。3.AKT/mTOR/ULK1信号通路在OPG调控破骨细胞自噬中的作用为了探究AKT/mTOR/ULK1信号通路在OPG调控破骨细胞自噬中的作用,本研究利用Western blotting检测AKT、mTOR、ULK1等蛋白的磷酸化水平,免疫荧光检测LC3和LAMP2共定位,透射电镜检测双层膜结构的自噬小体。结果发现,OPG能够剂量依赖性地降低P-AKT和P-mTOR蛋白表达,上调P-ULK1蛋白表达。OPG可以增强PI3K/AKT阻断剂LY294002对P-AKT和P-mTOR的抑制作用,同时增强了 RAP对P-AKT的抑制,促进了破骨细胞的自噬,结果提示OPG通过抑制AKT/mTOR通路使破骨细胞的自噬水平增强;OPG可以显著增强LC3和LAMP2荧光强度,并呈现显著的共定位,添加自噬抑制剂3-MA可以显著减弱荧光强度,mTOR抑制剂RAP可以显著增强自噬水平,表现出荧光强度增加;OPG减弱了 3-MA对破骨细胞自噬的抑制,较3-MA单独处理组,OPG和3-MA共处理组中自噬溶酶体的数量显著增多。说明40 ng/mL OPG可以通过AKT/mTOR/ULK1信号通路显著增强分化至3d的破骨细胞自噬水平。