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目的:本课题组前期发现钙网蛋白(Calreticulin,CRT)在鼻咽癌组织中高表达,通过诱导鼻咽癌CNE2细胞发生上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)促进其迁移侵袭。本文旨在探究CRT诱导鼻咽癌CNE2细胞EMT相关信号通路,及其促迁移侵袭的分子机制。 方法:(1)采用Ensembl在线生物信息学软件预测NRP1的启动子区域序列,然后通过Jaspar软件预测转录因子结合位点,分析TGF-β/Smads信号通路中调控神经纤毛蛋白1(Neuropilin-1,NRP1)表达最佳转录因子。 (2)将Si-CRT瞬时转染鼻咽癌细胞CNE2细胞(设阴性对照Si-NControl),运用Western blot检测CRT低表达后细胞中SMAD3与其磷酸化、NRP1表达水平。 (3)利用SMAD3特异性磷酸化抑制剂SIS3处理CNE2细胞,Western blot检测抑制SMAD3蛋白磷酸化后CRT与NRP1表达情况。 (4)通过Western blot检测CNE2细胞中CRT低表达以及抑制SMAD3磷酸化后EMT相关蛋白E-cadherin和Vimentin表达情况。 (5)通过划痕实验和Transwell迁移侵袭实验检测CNE2细胞中CRT低表达以及抑制SMAD3磷酸化后对鼻咽癌细胞迁移侵袭的影响。 结果:(1)Ensembl软件发现NRP1基因转录起始位点上游2000bp碱基序列(-1~-2000bp)为NRP1启动子区域。经Jaspar软件分析发现TGF-β/Smads信号通路中SMAD3在NRP1启动子区域存在5个结合位点。 (2)敲低CRT后鼻咽癌CNE2细胞中NRP1与P-SMAD3表达水平显著降低(P=0.000),但SMAD3表达无差异(P=0.240)。 (3)SIS3抑制鼻咽癌CNE2细胞中SMAD3磷酸化后NRP1蛋白表达明显下调(P=0.020),而CRT表达无显著差异(P=0.140)。 (4)敲低鼻咽癌CNE2细胞中CRT表达或者抑制SMAD3的磷酸化后,EMT相关蛋白Vimentin显著降低(P<0.01),但E-cadherin表达增加(P<0.01)。 (5)细胞划痕实验结果显示:敲低CRT表达后鼻咽癌CNE2细胞迁移距离为(13.42±3.15)μm,抑制SMAD3磷酸化后CNE2细胞迁移距离为(18.01±2.82)μm,两组间无明显差异(P>0.05),但均显著低于阴性对照组(60.41±4.00)μm(P<0.05)。 (6)Trasnwell迁移实验结果证实:敲低CRT表达后鼻咽癌CNE2细胞迁移细胞计数为(74.03±1.00个/高倍镜视野),抑制SMAD3磷酸化后CNE2细胞迁移细胞计数为(69.02±3.68个/高倍镜视野),两组间无明显差异(P>0.05),但均显著低于阴性对照组(124.12±5.80个/高倍镜视野)(P<0.05)。 (7)Trasnwell侵袭实验结果证实:敲低CRT表达后鼻咽癌CNE2细胞迁移细胞计数为(63.11±6.45个/高倍镜视野),抑制SMAD3磷酸化后CNE2细胞迁移细胞计数为(54.65±6.20个/高倍镜视野),两组间无明显差异(P>0.05),但均显著低于阴性对照组(96.62±5.68个/高倍镜视野)(P<0.05)。 结论:(1)CRT通过促进TGF-β信号通路中Smad3磷酸化调控NRP1表达。 (2)CRT可经Smad3/NRP1通路诱导鼻咽癌CNE2细胞发生EMT,促进其迁移和侵袭。