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目的:卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，由于其高复发率、易转移而具有极高的病死率。随着近年来对维生素D非经典作用的不断探索，活性维生素D(1α，25-dihydroxy-vitaminD3，1α，25(OH)2D3)抑制恶性肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭方面的功能被不断揭示。本课题组前期的研究发现，在自发恶性转化的小鼠卵巢表面上皮细胞中，长期使用活性维生素D处理后，活性维生素D对其增殖、迁移和侵袭的抑制作用减弱了。而在这期间维生素D关键代谢酶24羟化酶(Cytochrome P450 family 24 subfamily A member 1，CYP24A1)的表达量出现明显升高。CYP24A1是维生素D代谢途径中关键的一种酶，其在体内可以将活性维生素D转化为非活性形式，从而使活性维生素D无法发挥正常的生物学效应。另外，有研究结果表明CYP24A1在肺癌、宫颈癌、乳腺癌和结肠癌中的表达量要明显高于癌旁正常组织，而且认为CYP24A1可能是一个候选的癌基因。为了探索CYP24A1在卵巢癌中是否具有癌基因样作用，本研究使用慢病毒转染的方式构建了稳定过表达或敲低CYP24A1的卵巢癌细胞株，研究CYP24A1的表达量对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，同时使用pulldown-质谱实验检测与CYP24A1直接互作的相关蛋白，进一步揭示了CYP24A1影响卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制。为卵巢癌的临床防治提供了新的靶标和策略。
方法:本研究分为三个部分。(1)过表达维生素D代谢酶CYP24A1促进卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭:通过TCGA数据库查询CYP24A1在卵巢癌和正常组织的表达情况，使用组织芯片检测CYP24A1在卵巢癌组织、正常组织及良性腺瘤组织中的表达情况;使用过表达CYP24A1质粒的慢病毒转染卵巢癌细胞株，Western-blotting和Real-TimePCR实验用于验证稳定过表达CYP24A1的卵巢癌细胞株构建是否成功;使用CCK-8和平板克隆实验检测过表达CYP24A1对卵巢癌细胞增殖能力的影响，分别使用增殖率(=(24小时或48小时吸光度-0小时吸光度)/0小时吸光度)和增殖能力(用吸光度值反映存活的细胞数量)表示;使用划痕实验检测过表达CYP24A1对卵巢癌细胞迁移能力的影响，用迁移指数(=(划痕宽度-初始划痕宽度)/初始划痕宽度)表示;使用Transwell实验评估过表达CYP24A1对卵巢癌细胞侵袭能力的影响，用侵袭能力(用吸光度值反映穿过Transwell小室底膜的细胞数量)表示。(2)敲低维生素D代谢酶CYP24A1抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭:使用课题组建立的稳定敲低CYP24A1的卵巢癌细胞，CCK-8和平板克隆实验用于评估敲低CYP24A1对卵巢癌细胞株增殖能力的影响，分别使用增殖率和增殖能力表示;使用划痕实验评估敲低CYP24A1对卵巢癌细胞株迁移能力的影响，同样用迁移指数表示;通过Transwell实验检测敲低CYP24A1对卵巢癌细胞侵袭能力的影响，用侵袭能力(用有效细胞的面积反映穿过Transwell小室底膜的细胞数量)表示。(3)CYP24A1与FUS直接相互作用促进卵巢癌细胞的EMT过程:通过pulldown-质谱实验寻找与Flag-CYP24A1存在直接相互作用的蛋白，发现RNA结合蛋白FUS(Fused in Sarcoma)可能与Flag-CYP24A1存在直接相互作用关系。有文献曾指出FUS可以促进miR-200c对ZEB1的抑制作用，进而抑制EMT(Epithelial-mesenchymal transition)并影响细胞的转移能力，这与本研究之前的研究内容是相关的。所以，利用免疫共沉淀和免疫荧光方法验证CYP24A1与FUS的相互作用关系;酵母双杂交实验明确CYP24A1与FUS的相互作用位点;进一步通过pulldown实验研究CYP24A1及其突变体与FUS的互作关系;使用Western-blotting检测不同表达水平的CYP24A1对卵巢癌细胞FUS表达量的影响;使用Real-TimePCR检测过表达或敲低CYP24A1对卵巢癌细胞miR-200c表达水平的影响;同时，利用Western-blotting检测不同表达量的CYP24A1对卵巢癌细胞中EMT关键转录因子ZEB1和Snail，以及EMT相关蛋白E-cadherin和Vimentin表达水平的影响，探讨CYP24A1影响卵巢癌细胞株增殖、迁移和侵袭的分子机制。
结果:
1、过表达维生素D代谢酶CYP24A1促进卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭
TCGA数据库查询的结果显示，卵巢癌组织中CYP24A1的表达水平要高于正常组织(p＞0.05)，卵巢癌患者组织芯片的结果显示，肿瘤组织中CYP24A1的表达水平高于正常及良性腺瘤组织(p＜0.01)。Real-TimePCR和Western-blotting的实验结果显示，与转染空载体的阴性对照SKOV-3和OVCAR-8细胞相比较，CYP24A1的mRNA和蛋白水平都显著升高(p＜0.05)，说明我们成功地构建了CYP24A1过表达的卵巢癌细胞株。平板克隆实验发现，与转染空载体的阴性对照组相比较，过表达CYP24A1组的卵巢癌细胞生长速度明显增快(p＜0.01)，CCK-8实验也显示过表达组细胞在24小时和48小时的增殖率明显提高(p＜0.05)。划痕实验显示，与阴性对照组细胞相比较，过表达组卵巢癌细胞的迁移指数在划痕后的12小时和24小时变化不大，但是在48小时明显升高(p＜0.05)。Transwell实验显示，与阴性对照组相比较，过表达组的卵巢癌细胞侵袭能力要明显增强(p＜0.01)。以上实验结果说明，过表达CYP24A1可以促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
2、敲低维生素D代谢酶CYP24A1抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭
平板克隆实验显示，与转染空载体的阴性对照组相比较，敲低CYP24A1组的卵巢癌细胞生长速度明显变慢(p＜0.01)，CCK-8实验也显示敲低组细胞在24小时和48小时的增殖率明显降低(p＜0.01)。划痕实验显示，与阴性对照组相比较，敲低组卵巢癌细胞的迁移指数在划痕后的24小时和48小时均明显降低(p＜0.05)。Transwell实验显示，与阴性对照组相比较，敲低组的卵巢癌细胞侵袭能力明显减弱(p＜0.05)。以上实验结果说明敲低CYP24A1可以抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
3、CYP24A1与FUS直接相互作用抑制卵巢癌细胞的EMT过程
(1)CYP24A1与FUS存在直接互作关系
通过pulldown-质谱实验寻找与Flag-CYP24A1存在直接相互作用的蛋白，发现RNA结合蛋白FUS与Flag-CYP24A1存在直接相互作用关系。由于文献报道FUS能够促进miR-200c对ZEB1表达的抑制，进而抑制EMT过程，降低细胞的转移能力，这与本论文前两部分的研究内容相关。因此，本研究使用免疫共沉淀实验证实两者之间的互作关系，发现卵巢癌细胞中Flag-CYP24A1与FUS之间存在直接相互作用关系。酵母双杂交和pulldown实验也明确与FUS直接互作的必须结构域为CYP24A1蛋白的87-239位氨基酸之间，这一氨基酸序列的缺失使得CYP24A1与FUS不能直接互作，CYP24A1的237位氨基酸可能是CYP24A1与FUS互作的关键位点之一。免疫荧光实验显示，在卵巢癌细胞OVCAR-8中FUS与Flag-CYP24A1均定位于细胞核及其周边，但卵巢癌细胞SKOV-3中两种蛋白的定位并非完全一致，其中原因有待进一步研究。以上实验结果说明CYP24A1与FUS直接相互作用的结构域为87-239位氨基酸之间，而且237位氨基酸是CYP24A1与FUS互作的关键位点之一。
(2)CYP24A1对卵巢癌细胞中FUS/miR-200c/ZEB1表达水平的影响
Western-blotting的实验结果发现，过表达CYP24A1可以显著减少OVCAR-8细胞FUS的表达量(p＜0.05)，而减少CYP24A1表达则增加OVCAR-8细胞FUS的表达量(p＜0.05)。Real-TimePCR的实验结果显示，过表达CYP24A1减少OVCAR-8细胞miR-200c的表达量(p＞0.05);反之，减少CYP24A1的表达增加OVCAR-8细胞miR-200c的表达(p＜0.05)。说明CYP24A1过表达可以减少FUS和miR-200c的表达量。《MolecularCell》于2018年报道，FUS可以促进miR-200c对EMT关键转录因子ZEB1表达的抑制作用，而且miR-200c和ZEB1是保守的miRNA-mRNA对，其水平受FUS调节。《Oncogene》也曾报道，miR-200c对ZEB1的表达有抑制作用。因此，本研究继续研究不同表达水平的CYP24A1对ZEB1的影响。Western-blotting实验发现，过表达CYP24A1后OVCAR-8细胞EMT关键转录因子ZEB1出现明显升高(p＜0.05)，SKOV-3细胞有升高的趋势，但没有统计学意义。敲低CYP24A1后OVCAR-8细胞ZEB1表达显著减少(p＜0.05)，SKOV-3细胞有下降趋势，但是没有统计学意义。以上实验结果说明过表达CYP24A1可以减少FUS的表达量，从而减弱miR-200c对ZEB1的抑制作用，即增加ZEB1的表达水平。
(3)CYP24A1对卵巢癌细胞EMT相关蛋白表达量的影响
ZEB1表达量的改变提示我们CYP24A1表达水平的变化很可能影响EMT的进展。因此，本课题继续探讨不同表达水平的CYP24A1对其他EMT相关蛋白的影响。Western-blotting实验发现，过表达CYP24A1后EMT转录因子Snail表达量的变化不够明显，上皮细胞标志物E-cadherin表达量显著下降(p＜0.05)，间质细胞标志物Vimentin的表达量则出现略微上调，但是没有统计学意义。反之，敲低CYP24A1后OVCAR-8细胞Snail表达明显减少(p＜0.05)，SKOV-3细胞有下降趋势，但是没有统计学意义(p＞0.05)。同时，敲低组卵巢癌细胞E-cadherin表达量明显上升(p＜0.05)，Vimentin的表达则明显下降(p＜0.05)。以上实验结果说明，减少CYP24A1表达可以上调EMT上皮标志物E-cadherin的表达量，下调间质标志物Vimentin和转录因子Snail的表达水平。
第三部分的实验结果说明，CYP24A1的87-239位氨基酸结构域与FUS直接互作，减少FUS的表达量，从而减弱miR-200c对ZEB1的抑制作用，促进EMT的进程。
结论:
1、卵巢癌组织中CYP24A1的表达水平高于正常组织及良性腺瘤组织，过表达维生素D代谢酶CYP24A1可以促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;
2、敲低维生素D代谢酶CYP24A1可以抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;
3、维生素D代谢酶CYP24A1的87-239位氨基酸为CYP24A1与FUS直接互作的必须结构域，CYP24A1与FUS直接相互作用抑制FUS的表达，减弱miR-200c对ZEB1的抑制作用;同时，下调E-cadherin的表达，上调Vimentin和Snail的表达。说明CYP24A1/FUS/miR-200c/ZEB1通路激活促进卵巢癌细胞EMT的进展。
方法:本研究分为三个部分。(1)过表达维生素D代谢酶CYP24A1促进卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭:通过TCGA数据库查询CYP24A1在卵巢癌和正常组织的表达情况，使用组织芯片检测CYP24A1在卵巢癌组织、正常组织及良性腺瘤组织中的表达情况;使用过表达CYP24A1质粒的慢病毒转染卵巢癌细胞株，Western-blotting和Real-TimePCR实验用于验证稳定过表达CYP24A1的卵巢癌细胞株构建是否成功;使用CCK-8和平板克隆实验检测过表达CYP24A1对卵巢癌细胞增殖能力的影响，分别使用增殖率(=(24小时或48小时吸光度-0小时吸光度)/0小时吸光度)和增殖能力(用吸光度值反映存活的细胞数量)表示;使用划痕实验检测过表达CYP24A1对卵巢癌细胞迁移能力的影响，用迁移指数(=(划痕宽度-初始划痕宽度)/初始划痕宽度)表示;使用Transwell实验评估过表达CYP24A1对卵巢癌细胞侵袭能力的影响，用侵袭能力(用吸光度值反映穿过Transwell小室底膜的细胞数量)表示。(2)敲低维生素D代谢酶CYP24A1抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭:使用课题组建立的稳定敲低CYP24A1的卵巢癌细胞，CCK-8和平板克隆实验用于评估敲低CYP24A1对卵巢癌细胞株增殖能力的影响，分别使用增殖率和增殖能力表示;使用划痕实验评估敲低CYP24A1对卵巢癌细胞株迁移能力的影响，同样用迁移指数表示;通过Transwell实验检测敲低CYP24A1对卵巢癌细胞侵袭能力的影响，用侵袭能力(用有效细胞的面积反映穿过Transwell小室底膜的细胞数量)表示。(3)CYP24A1与FUS直接相互作用促进卵巢癌细胞的EMT过程:通过pulldown-质谱实验寻找与Flag-CYP24A1存在直接相互作用的蛋白，发现RNA结合蛋白FUS(Fused in Sarcoma)可能与Flag-CYP24A1存在直接相互作用关系。有文献曾指出FUS可以促进miR-200c对ZEB1的抑制作用，进而抑制EMT(Epithelial-mesenchymal transition)并影响细胞的转移能力，这与本研究之前的研究内容是相关的。所以，利用免疫共沉淀和免疫荧光方法验证CYP24A1与FUS的相互作用关系;酵母双杂交实验明确CYP24A1与FUS的相互作用位点;进一步通过pulldown实验研究CYP24A1及其突变体与FUS的互作关系;使用Western-blotting检测不同表达水平的CYP24A1对卵巢癌细胞FUS表达量的影响;使用Real-TimePCR检测过表达或敲低CYP24A1对卵巢癌细胞miR-200c表达水平的影响;同时，利用Western-blotting检测不同表达量的CYP24A1对卵巢癌细胞中EMT关键转录因子ZEB1和Snail，以及EMT相关蛋白E-cadherin和Vimentin表达水平的影响，探讨CYP24A1影响卵巢癌细胞株增殖、迁移和侵袭的分子机制。
结果:
1、过表达维生素D代谢酶CYP24A1促进卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭
TCGA数据库查询的结果显示，卵巢癌组织中CYP24A1的表达水平要高于正常组织(p＞0.05)，卵巢癌患者组织芯片的结果显示，肿瘤组织中CYP24A1的表达水平高于正常及良性腺瘤组织(p＜0.01)。Real-TimePCR和Western-blotting的实验结果显示，与转染空载体的阴性对照SKOV-3和OVCAR-8细胞相比较，CYP24A1的mRNA和蛋白水平都显著升高(p＜0.05)，说明我们成功地构建了CYP24A1过表达的卵巢癌细胞株。平板克隆实验发现，与转染空载体的阴性对照组相比较，过表达CYP24A1组的卵巢癌细胞生长速度明显增快(p＜0.01)，CCK-8实验也显示过表达组细胞在24小时和48小时的增殖率明显提高(p＜0.05)。划痕实验显示，与阴性对照组细胞相比较，过表达组卵巢癌细胞的迁移指数在划痕后的12小时和24小时变化不大，但是在48小时明显升高(p＜0.05)。Transwell实验显示，与阴性对照组相比较，过表达组的卵巢癌细胞侵袭能力要明显增强(p＜0.01)。以上实验结果说明，过表达CYP24A1可以促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
2、敲低维生素D代谢酶CYP24A1抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭
平板克隆实验显示，与转染空载体的阴性对照组相比较，敲低CYP24A1组的卵巢癌细胞生长速度明显变慢(p＜0.01)，CCK-8实验也显示敲低组细胞在24小时和48小时的增殖率明显降低(p＜0.01)。划痕实验显示，与阴性对照组相比较，敲低组卵巢癌细胞的迁移指数在划痕后的24小时和48小时均明显降低(p＜0.05)。Transwell实验显示，与阴性对照组相比较，敲低组的卵巢癌细胞侵袭能力明显减弱(p＜0.05)。以上实验结果说明敲低CYP24A1可以抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
3、CYP24A1与FUS直接相互作用抑制卵巢癌细胞的EMT过程
(1)CYP24A1与FUS存在直接互作关系
通过pulldown-质谱实验寻找与Flag-CYP24A1存在直接相互作用的蛋白，发现RNA结合蛋白FUS与Flag-CYP24A1存在直接相互作用关系。由于文献报道FUS能够促进miR-200c对ZEB1表达的抑制，进而抑制EMT过程，降低细胞的转移能力，这与本论文前两部分的研究内容相关。因此，本研究使用免疫共沉淀实验证实两者之间的互作关系，发现卵巢癌细胞中Flag-CYP24A1与FUS之间存在直接相互作用关系。酵母双杂交和pulldown实验也明确与FUS直接互作的必须结构域为CYP24A1蛋白的87-239位氨基酸之间，这一氨基酸序列的缺失使得CYP24A1与FUS不能直接互作，CYP24A1的237位氨基酸可能是CYP24A1与FUS互作的关键位点之一。免疫荧光实验显示，在卵巢癌细胞OVCAR-8中FUS与Flag-CYP24A1均定位于细胞核及其周边，但卵巢癌细胞SKOV-3中两种蛋白的定位并非完全一致，其中原因有待进一步研究。以上实验结果说明CYP24A1与FUS直接相互作用的结构域为87-239位氨基酸之间，而且237位氨基酸是CYP24A1与FUS互作的关键位点之一。
(2)CYP24A1对卵巢癌细胞中FUS/miR-200c/ZEB1表达水平的影响
Western-blotting的实验结果发现，过表达CYP24A1可以显著减少OVCAR-8细胞FUS的表达量(p＜0.05)，而减少CYP24A1表达则增加OVCAR-8细胞FUS的表达量(p＜0.05)。Real-TimePCR的实验结果显示，过表达CYP24A1减少OVCAR-8细胞miR-200c的表达量(p＞0.05);反之，减少CYP24A1的表达增加OVCAR-8细胞miR-200c的表达(p＜0.05)。说明CYP24A1过表达可以减少FUS和miR-200c的表达量。《MolecularCell》于2018年报道，FUS可以促进miR-200c对EMT关键转录因子ZEB1表达的抑制作用，而且miR-200c和ZEB1是保守的miRNA-mRNA对，其水平受FUS调节。《Oncogene》也曾报道，miR-200c对ZEB1的表达有抑制作用。因此，本研究继续研究不同表达水平的CYP24A1对ZEB1的影响。Western-blotting实验发现，过表达CYP24A1后OVCAR-8细胞EMT关键转录因子ZEB1出现明显升高(p＜0.05)，SKOV-3细胞有升高的趋势，但没有统计学意义。敲低CYP24A1后OVCAR-8细胞ZEB1表达显著减少(p＜0.05)，SKOV-3细胞有下降趋势，但是没有统计学意义。以上实验结果说明过表达CYP24A1可以减少FUS的表达量，从而减弱miR-200c对ZEB1的抑制作用，即增加ZEB1的表达水平。
(3)CYP24A1对卵巢癌细胞EMT相关蛋白表达量的影响
ZEB1表达量的改变提示我们CYP24A1表达水平的变化很可能影响EMT的进展。因此，本课题继续探讨不同表达水平的CYP24A1对其他EMT相关蛋白的影响。Western-blotting实验发现，过表达CYP24A1后EMT转录因子Snail表达量的变化不够明显，上皮细胞标志物E-cadherin表达量显著下降(p＜0.05)，间质细胞标志物Vimentin的表达量则出现略微上调，但是没有统计学意义。反之，敲低CYP24A1后OVCAR-8细胞Snail表达明显减少(p＜0.05)，SKOV-3细胞有下降趋势，但是没有统计学意义(p＞0.05)。同时，敲低组卵巢癌细胞E-cadherin表达量明显上升(p＜0.05)，Vimentin的表达则明显下降(p＜0.05)。以上实验结果说明，减少CYP24A1表达可以上调EMT上皮标志物E-cadherin的表达量，下调间质标志物Vimentin和转录因子Snail的表达水平。
第三部分的实验结果说明，CYP24A1的87-239位氨基酸结构域与FUS直接互作，减少FUS的表达量，从而减弱miR-200c对ZEB1的抑制作用，促进EMT的进程。
结论:
1、卵巢癌组织中CYP24A1的表达水平高于正常组织及良性腺瘤组织，过表达维生素D代谢酶CYP24A1可以促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;
2、敲低维生素D代谢酶CYP24A1可以抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;
3、维生素D代谢酶CYP24A1的87-239位氨基酸为CYP24A1与FUS直接互作的必须结构域，CYP24A1与FUS直接相互作用抑制FUS的表达，减弱miR-200c对ZEB1的抑制作用;同时，下调E-cadherin的表达，上调Vimentin和Snail的表达。说明CYP24A1/FUS/miR-200c/ZEB1通路激活促进卵巢癌细胞EMT的进展。