研究背景和目的急性白血病是儿童中最常见的癌症类型。尽管该疾病的治疗取得了进展,但仍有约20%的患者死于耐药或复发^[1]。在过去的十年中,分子研究已经发现与儿童急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）和急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia,ALL）相关的遗传标记越来越多,这些标志物可以增强风险分层,改变治疗策略可改善患者预后。ALL常伴有与淋巴细胞发育和细胞周期调控有关的基因突变和染色体易位^[2]。现在越来越多的证据表明,表观遗传学改变（包括DNA甲基化差异）会影响白血病的易感性和预后^[3]。组蛋白甲基化失调可能影响与肿瘤发生有关的重要细胞过程,例如增殖和分化,从而导致肿瘤^[4]。TET2是10-11易位基因家族的成员,催化DNA中的5-甲基胞嘧啶向5-羟甲基胞嘧啶的转化。SET和MYND结构域蛋白2（SMYD2）是一种甲基转移酶,可以调节包括组蛋白在内的几种蛋白质的活性^[5]。两种基因的异常表达都被报道与血液肿瘤相关^[6,7]。我们前期的实验已经证实了TET2基因m RNA水平的降低和SMYD2基因m RNA水平的升高是儿童ALL的预后不良因素。相比较于ALL,儿童AML相对预后不良,治愈率更低。随着优化化疗方案,开展造血干细胞移植等技术,儿童AML的治疗效果虽有了明显提高,但始终有部分AML患儿无法耐受化疗、复发及原发耐药而治疗失败。白血病干细胞（leukemia stem cells,LSCs）是儿童AML复发或耐药的根源^[8]。对复发难治性AML来说,常规化疗已无法彻底杀灭LSCs,迫切需要寻求新的治疗方法。近年来,以CD19为靶标的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞在B系肿瘤的应用中已取得令人瞩目的成果,这也给儿童复发难治性AML的治疗带来新的希望,但少有靶点被批准用于AML临床治疗,到目前为止,仅CD123-CAR被美国FDA批准用于复发难治性AML的临床治疗,而其他靶点的CAR仍在进行治疗试验中,现正在研发的AML-CAR靶标包括CD33,CD123,FLT3,Lewis-Y和CLL-1等靶点,但效果大多不良,迫切需要寻找新的靶点。3A4是本课题组前期研制的单抗,它是可识别人CD45亚类的Ig Gκ类抗体。我们之前实验显示,3A4仅识别B系肿瘤细胞、正常B细胞、髓系白血病和其干细胞、na?ve T细胞、少量单核细胞,而不识别红细胞、嗜中性粒细胞、正常记忆T细胞、血小板和大部分造血干细胞,是一个靶向AML的良好靶点。究其原因,CAR的成功率一方面与靶点调变有关系,另一方面,跟识别靶点单源抗体人源化的程度有关。大多数CAR是鼠源的,鼠源CAR对人体有免疫原性,可产生抗sc Fv抗体,CAR被中和导致CAR的功能大大被削弱。为了解决这个问题,我们提出用人源化CAR,可明显降低抗sc Fv抗体的产生,从而保证CAR的杀伤活性;为此,3A4抗体已进行了人源化改造,取名为Hu3A4,人源化程度达到93%（课题组前期研究结果）。Hu3A4可特异性结合髓系和B系LSCs,并对髓系KG1a细胞有较强的靶向杀伤作用,利用Hu3A4单抗构建Hu3A4-CAR,靶向杀伤白血病干细胞和治疗难治性AML具有重要科学意义及临床应用前景。本研究包含如下四个部分:1.识别髓系白血病人源化3A4-CAR（Hu3A4-CAR）慢病毒表达载体的构建;2.Hu3A4-CAR慢病毒包装、浓缩、滴度测定研究和Hu3A4-CAR在T细胞的成功表达及体外扩增;3.Hu3A4-CAR-T对白血病细胞的体外靶向杀伤作用及机制,与Mu3A4-CAR-T靶向杀伤差异的比较研究;4.Hu3A4-CAR-T靶向治疗白血病动物模型的作用及与Mu3A4-CAR-T靶向抗肿瘤差异的比较研究。方法1 识别AML-LSC的Hu3A4-CAR表达载体的构建1.1 二代真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ的构建:检索文献,确定二代CAR的基因结构,核实Hu3A4-CAR胞外区、跨膜区和胞内区各个结构的基因序列;通过分子克隆技术进行构建真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ。1.2 Hu3A4-CAR真核表达载体和慢病毒表达载体的活性鉴定:采用瞬时转染CHO细胞的方法,用流式细胞术（FCM）法检测验证Hu3A4-CAR基因是否表达,并比较两种载体表达CAR效率的差别,选择出效率高的表达载体用于下一步实验。2 Hu3A4-CAR在T细胞的成功表达2.1慢病毒包装及滴度鉴定:包装质粒Rev,Gag-Pol,Vsvg及表达质粒p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ的大量抽提后,选用人胚肾293T细胞作包装细胞,脂质体作用下对包装质粒和表达质粒进行包装,收集携有Hu3A4-CAR慢病毒的上清液并测定慢病毒滴度。2.2 Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR在T细胞的成功表达和体外扩增:Ficoll密度梯度离心法分离人外周血中T细胞,抗人CD3/28磁珠及IL-2活化刺激T细胞、然后用含Hu3A4-CAR基因的慢病毒转导到T细胞中。采用RT-PCR,Western blot、流式细胞术分别鉴定Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR是否表达于T细胞。研究Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T在体外培养的扩增倍数。3 Hu3A4-CAR-T的体外靶向杀伤作用及与Mu3A4-CAR-T靶向杀伤差异的比较研究:细胞形态学和流式细胞仪结合检测Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T与3A4⁺靶细胞的靶向结合情况,并比较在不同效靶比其靶向结合率的变化;采用Calcein-AM释放法检验Hu3A4-CAR-T细胞靶向杀伤KG1a细胞株及新发AML患者体内的白血病细胞的作用,并与Mu3A4-CAR-T靶向杀伤差异进行比较研究;FCM CBA法检测Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T靶向杀伤靶细胞时分泌细胞因子的水平;Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T杀伤机制研究:Real-time PCR法验证Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T靶向杀伤时穿孔素（perforin,PFN）基因和颗粒酶B（granzyme B,GZM-B）表达是否变化。采用Ficoll密度梯度离心法分离健康骨髓中的单个核细胞（bone marrow mononuclear cells,BMMNCs）,将BMMNCs、Hu3A4-CAR-T细胞和Mu3A4-CAR-T细胞充分洗涤,计数并重悬在IMDM培养基中。将5×10³个BMMCs分别与具有良好特异性靶向杀伤功能的Hu3A4-CAR-T细胞和Mu3A4-CAR-T细胞以效应细胞:靶细胞=10:1的比例共孵育20小时,然后将细胞悬液转移至含有重组细胞生长因子基于甲基纤维素的半固体培养基Metho Cult SF H4436（加拿大Stem cell公司）,并一式两份铺板。14天后,在光学显微镜下通过形态学观察CFU集落并进行分类计数。4 AML小鼠模型体内Hu3A4-CAR-T抗肿瘤作用及与Mu3A4-CAR-T抗肿瘤差异的研究:实验选用NOD/SCID小鼠,设为模型组、空白对照组、T细胞治疗对照组、Hu3A4-CAR-T细胞治疗组和Mu3A4-CAR-T细胞治疗组,共5组,每组6只;先予浓度10mg/ml的环磷酰胺预处理,每只小鼠200ul连续腹腔注射2天;除PBS组外,其余4组小鼠每只接种2x10⁶KG1a细胞以建立AML的动物模型,在注射KG1a细胞后第一天和第二天,予T细胞、Hu3A4-CAR-T细胞和Mu3A4-CAR-T细胞静脉输注;监测小鼠的体重变化、观察精神状态,有无活动减少、行动迟缓、弓背抬高等发病症状;每1-3周小鼠眶周静脉采血,流式检测Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T细胞的植入与存留情况,细胞因子的水平;记录小鼠发病和死亡的日期,绘制生存曲线,比较各组小鼠之间生存时间的差别。观察各组小鼠器官的病理与免疫组化的结果。结果1识别AML-LSC的Hu3A4-CAR表达载体的构建1.1真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ的构建:我们确定构建二代CAR的基因,Hu3A4-CAR的基本结构:CD8a leader是Hu3A4-CAR的前导序列,Hu3A4-sc Fv是靶向识别区,CD8a hinge是铰链区,CD8a TM是Hu3A4-CAR的跨膜区,4-1BB的胞内共刺激信号转导区和CD3ζ的内信号转导区则串联连构成Hu3A4-CAR的胞内段。我们构建了Hu3A4-CAR的二代真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ。测序结果表明,基因序列与设计序列一致,说明载体构建成功,能用于下一步实验。1.2 Hu3A4-CAR真核表达载体及慢病毒表达载体活性鉴定:FCM法证实我们构建的Hu3A4-CAR的真核表达载体及慢病毒表达载体都是有活性的载体,可成功地在CHO细胞表达Hu3A4-CAR重组蛋白。就表达效率来说,慢病毒载体高于真核表达载体（36%vs.24.3%,P=0.046）。2 Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR在T细胞的成功表达2.1 慢病毒包装及滴度鉴定:293T细胞成功包装了含Hu3A4-CAR基因和Mu3A4-CAR基因的慢病毒,采用q RT-PCR测定Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR慢病毒滴度在5 x10⁵数量级以上。2.2 Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR在T细胞的成功表达和体外扩增:RT-PCR、Western blot和流式细胞术鉴定Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T的表达,3种方法均证明,Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR基因能成功导入且表达于T细胞表面。慢病毒感染体系感染人活化原代T细胞中的感染效率在42%-62%。在CD3/CD28磁珠活化T细胞,1640完全培养基加上IL-2的培养条件下,Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T细胞在体外能扩增110-200倍,两者之间扩增倍数无统计学差异（平均扩增倍数分别为130倍和135倍,P>0.05）。3 Hu3A4-CAR-T的体外靶向杀伤作用及与Mu3A4-CAR-T靶向杀伤差异的比较研究:Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T均可靶向识别和结合3A4+的KG1a及Raji细胞,并随着效靶比例的增加,其与靶细胞的结合率也升高。Calcein-AM是一种荧光染料,在活细胞内荧光较为稳定,而在死细胞内荧光不明显,被Calcein-AM标记的靶细胞,分别与Hu3A4-CAR-T、Mu3A4-CAR-T及普通T细胞共孵育24小时。FCM显示与T细胞共孵育24小时的靶细胞,Calcein-AM阳性率为（95.3+0.3%）,在FITC通道可被检测到绿色荧光,而与Hu3A4-CAR-T及Mu3A4-CAR-T共孵育24小时的靶细胞,Calcein-AM阳性细胞分别为（17.2+0.5）%和（12.8+1.4）%,有大部分被CAR-T靶向结合而检测不到绿色荧光,两组间无统计学差异（P=0.079）,但分别与T细胞杀伤对照组有显著差异（P<0.001）,说明与CAR-T靶向结合的靶细胞被杀伤,随着效靶比的逐步升高,杀伤功能有不同程度的增强。Hu3A4-CAR-T及Mu3A4-CAR-T在靶向杀伤的过程中,可以引起IFN-γ分泌升高,效靶比为10:1时,Hu3A4-CAR-T及Mu3A4-CAR-T组分泌IFN-γ分别为69.4pg/ml和51.8pg/ml,两组之间差异无统计学意义（P=0.739）,但分别与T细胞杀伤对照组有显著差异（P<0.05）。用Real-time PCR方法可检测到颗粒酶B m RNA表达水平升高,CT值分别为0.0929和0.0925,差异无统计学意义（P=0.096）,但分别与T细胞杀伤对照组有显著差异（P<0.05）。Hu3A4-CAR-T、Mu3A4-CAR-T与5×10³个BMMNCs共孵育后进行集落形成单位（CFU）培养,14天后在倒置显微镜下观察集落形态并计数,未经CAR-T杀伤的造血干/祖细胞（对照组）的集落数为（26.3+0.88）/5x10³,而经Mu3A4-CAR-T和Hu3A4-CAR-T共孵育杀伤的造血干/祖细胞组的集落数分别为（27+1.15）/5x10³和（23+1.15）/5x10³,与对照组相比,CFU集落数差异无显著意义（P>0.05）。说明两种3A4-CAR-T细胞（人源化、鼠源）对骨髓造血干/祖细胞无明显影响。4 Hu3A4-CAR-T白血病小鼠模型体内抗肿瘤作用及与Mu3A4-CAR-T抗肿瘤差异的研究:设模型组、PBS空白对照组、T细胞治疗对照组、Hu3A4-CAR-T细胞治疗组和Mu3A4-CAR-T细胞治疗组共5组,每组小鼠6只。除PBS组注射PBS外,其余4组小鼠我们成功地通过尾静脉接种了KG1a细胞2x10⁶个/只,接种KG1a细胞后第一天和第二天,T细胞治疗组的小鼠予成功静脉输注了T细胞,Hu3A4-CAR-T细胞治疗组和Mu3A4-CAR-T细胞治疗组的小鼠分别成功地静脉注射了Hu3A4-CAR-T细胞和Mu3A4-CAR-T细胞;Hu3A4-CAR-T治疗组中的1只小鼠D2天予尾静脉注射Hu3A4-CAR-T后半小时死亡,其余小鼠继续进行实验。采用流式细胞仪检测两种3A4-CAR-T细胞在小鼠体内的存留,结果显示,在D11天Mu3A4-CAR-T细胞治疗组所有小鼠外周血中可以检测到Mu3A4-CAR-T细胞（0.005%-0.052%）,Hu3A4-CAR-T细胞治疗组的5只小鼠也都能检测到Hu3A4-CAR-T细胞（0.002%-0.127%）,遗憾的是,在D25天,Mu3A4-CAR-T细胞治疗组所有小鼠外周血中Mu3A4-CAR-T细胞水平<0.001%,而Hu3A4-CAR-T细胞治疗组只剩下2只小鼠能检测到Hu3A4-CAR-T（分别为0.003%和0.013%）,D41天这2只小鼠也没再检测到Hu3A4-CAR-T。至观察期（140天）结束,空白对照组NOD/SCID小鼠均存活;造模组小鼠和T细胞治疗对照组小鼠全部发病死亡,中位生存时间分别是54（44-94）天和59（52-140）天;Mu3A4-CAR-T治疗组有3只小鼠发病死亡,至观察期结束3只小鼠仍存活,中位生存时间为98（68-140）天;Hu3A4-CAR-T治疗组有3只小鼠存活至观察期结束,中位生存时间为89（2-140）天;各组小鼠间的生存时间差异具有统计学意义（P<0.05）。病理结果显示,发病小鼠的脑膜组织有肿瘤细胞浸润,免疫组化染色也证实了肿瘤细胞浸润了脑膜,这可能是导致小鼠出现后肢瘫痪的原因。而其他心、肺、肝、脾、肾、肠、胰腺等组织未见肿瘤细胞浸润。结论1.本研究通过分子克隆的方法成功地构建了以3A4为靶点的人源化真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ。两者能成功转染CHO细胞,慢病毒载体感染的效率要高于真核表达载体。2.慢病毒载体成功感染了293T细胞,包装成功的Hu3A4-CAR慢病毒和Mu3A4-CAR慢病毒能顺利感染T细胞,并在细胞水平、蛋白水平和分子水平得以证实。3.Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T细胞在体外能培养成功。CD3/CD28磁珠活化联合IL-2的体外培养可以使Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T细胞在2周的时间在体外扩增110-200倍。4. Hu3A4-CAR-T可靶向结合3A4+靶细胞,随效靶比例的升高,其与靶细胞的结合率也增加。Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T可靶向杀伤3A4+细胞株和新发AML患者体内的白血病细胞,但对3A4-的Nalm-6细胞无杀伤功能。在靶向杀伤过程中,鼠源和人源化3A4-CAR-T均伴随IFN-γ水平上升;同鼠源一样,人源化3A4-CAR-T可通过颗粒胞吐途径介导的溶细胞功能发挥杀伤活性。两种3A4-CAR-T细胞（人源化、鼠源）对骨髓造血干/祖细胞无明显影响。5. Hu3A4-CAR-T细胞及Mu3A4-CAR-T细胞在移植肿瘤动物体内均可以发挥抗肿瘤作用。