前言:单侧肺通气(One-lung ventilation,OLV)是心胸外科手术中常采用的一种特殊的通气模式,以求得手术侧肺萎陷为手术操作提供便利的空间和视野,同时也减少双侧肺之间交叉感染,但OLV可导致肺损伤,且随着单侧肺通气时间的延长,肺损伤会加重,甚至可引起多器官功能衰竭(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。探讨其发病机制及有效的临床干预路径,减轻单侧肺通气引起的肺损伤,可降低术后并发症的发生率和死亡率,缩短患者的住院时间。OLV可导致双侧肺不同程度的肺损伤,且其损伤的机制不同,随着双侧肺通气模式转换为单侧肺通气,膨胀侧肺持续通气,其损伤与气压、潮气量相关;非通气侧肺逐渐萎陷,其损伤与缺氧、氧化应激、肺复张以及手术操作有关。整个单侧肺通气过程中会产生大量促炎细胞因子和超氧离子,继而发生严重炎症反应及氧化应激反应。内皮素-1(endothelin,ET-1)是调节心血管功能的重要因子,是迄今为止发现的作用最强的缩血管物质,通过与内皮素受体结合而实现其作用。最近的研究表明,ET-1不仅可导致血管细胞纤维化,刺激活性氧的产生,促进氧化应激反应[7],还参与了转录因子NF-κB的激活和促炎症细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1等的表达[8]。各项实验研究发现,通过阻断内皮素受体可以减少缺血、缺氧刺激引起的肺组织损伤,对肺组织有保护作用。BQ-123是内皮素-1受体拮抗剂的一种,近年来越来越多研究结果表明,内皮素-1受体拮抗剂BQ-123在心脏、脑、肺等重要器官的缺血再灌注过程中具有保护作用。这些研究结果认为其保护机制可能与保护血管内皮细胞,降低毛细血管通透性,减少血管内的渗出,减少炎症细胞聚集,抗ET-1收缩血管效应,减少肺内分流,增加组织灌注,抑制脂质过氧化,提高抗氧化能力有关。然而有关BQ-123对单侧肺通气肺损伤保护的研究较少,且相关的信号通路研究尚无定论。探讨BQ-123对单侧肺通气肺损伤保护作用及进一步揭示其作用机理有助于临床相关的药物研究。磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K-Akt)信号通路是有效调节细胞生理病理机制的经典信号级联途径,参与真核细胞自噬、增值、凋亡等过程。研究显示[4],PI3K-Akt信号通路参与了 BQ-123对蛛网膜下腔出血早期脑损伤的保护过程。LY294002是PI3K的特异性抑制剂,可抑制PI3K-Akt信号通路。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是在缺氧状态下特异性发挥活性的核转录因子,是内源性的保护机制的始动因子和共同途径,是PI3K-Akt信号通路下游因子[5,6],且研究发现其对减轻缺血再灌注肺损伤有重要作用[7]。本研究试图通过建立兔单侧肺通气肺损伤模型,探讨内皮素-1受体拮抗剂对兔单侧肺通气时肺损伤的保护作用,通过检测PI3K-Akt信号通路及下游因子HIF-1α变化进一步揭示内皮素-1受体拮抗剂对兔单侧肺通气时肺损伤保护作用的机制。本研究分以下三个部分完成。第一部分兔单侧肺通气肺损伤模型的建立目的:建立兔单侧肺通气肺损伤模型。方法:1.实验动物及分组:清洁级健康日本大耳白兔,10只,雌雄不拘,体质量2.5±0.3kg,随机分为2组,每组5只,即双肺通气组(T组)、单肺通气组(O组)。T组进行双肺通气2.5h,O组进行单肺通气2h,然后再进行双肺通气0.5h。2.兔单侧肺通气模型的建立:经10%水合氯醛注射液耳缘静脉麻醉后,右侧颈外静脉建立静脉通路,左侧股动脉内置入24G留置针,并连接三通及换能器用于动脉采血及监测血压变化情况。行气管切开,插入带气囊的3.0号单腔气管导管,标记深度,连接动物呼吸机。参照蓝岚[18]的改良单腔气管导管过深法及通气参数建立兔单肺通气,于左侧第6肋间行小切口直视下观察,当左肺由通气膨胀转为萎陷状态视为右侧单肺通气模型建立成功。3.检测的指标:(1)取双侧上肺组织测量肺组织湿/干(W/D)比值。(2)取双下肺外基底段肺组织匀浆,取上清液,用ELISA法测兔肺组织TNF-α,IL-6含量。(3)取双下肺内基底段肺组织行病理切片,用普通光学显微镜观察并进行肺损伤评分。(4)在单肺通气前(T0)、单肺通气1小时(T1)、单肺通气2小时(T2)及双肺通气30分钟(T3)抽股动脉血0.5ml,行动脉血气分析测定pH、PaO2、PaCO2、HCO3-、BE,并计算氧合指数(Oxygenation index,OI),即动脉氧分压与吸入氧浓度比值(PaO2/FiO2)。参照相关文献报道,本研究从以下3个方面判别单侧肺通气肺损伤制模是否成功:①肺组织病理损伤评分>6分,达到重度肺损伤标准。②根据动脉血气分析计算OI值,当OI<300mmHg,达到轻度ARDS的标准。③肺组织中TNF-α及IL-6等细胞因子表达水平显著升高。4.统计学方法:应用SPSS 20.0统计软件分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,同侧肺两组间比较采用两独立样本t检验,组内左右肺比较采用配对t检验,不同时段不同分组间数据比较采用重复测量单因素方差分析,P<0.05认为有统计学意义。结果:1.不同时间点PaO2有统计学差异(F=8.614,P<0.05),T1、T2与T0比较PaO2 显著降低(105.8 ± 28.38mmHg、143.80 ± 64.09 mmHg vs 487.14 ±21.48mmHg,P<0.01);不同时间点PaCO2有统计学差异(F=5.162,P<0.05),T1 比 T0 时间点 PaCO2显著增加(52.60±5.68mmHgvs38.80±3.70mmHg,P<0.05),T3 与 T1 相比 PaCO2显著降低(36.40±6.02mmmHg vs 52.60±5.68mmHg,P<0.05);不同时间点间HCO3-有统计学差异(F=3.661,P<0.05),HCO3-在T1 跟 T2、T3 间有显著性差异(23.40 ±2.60mmol/L vs 19.36± 1.41mmol/L、17.64±2.18mmol/L,P<0.05);pH、B在在观察点无统计学差异(P>0.05)。2.肺组织W/D比值变化:比较O组与T组,左(t =-14.158,P<0.05)及右(t=-7.220,P<0.05)两侧肺组织W/D比值的组间差异有统计学意义。O组左侧肺组织的W/D比值较T组明显升高(5.55±0.17vs3.93±0.19,P=0.00),O组右侧肺组织的W/D比值较T组稍有升高(4.76±0.21 vs 3.76±0.23,P=0.00)。O组内左右肺比较,O组萎陷侧肺较通气侧肺的W/D比值明显增加(5.55±0.17 vs4.76±0.21,P<0.01),差异有统计学意义(t=-5.262,P<0.05)。T组内左右肺比较,W/D比值的差异无统计学意义(t=-1.351,P>0.05)。3.肺组织TNF-α、IL-6含量:相比两组,左侧肺组织的TNF-α含量(t=-5.955,P =0.00)及右侧肺组织TNF-α的含量(t=-10.848,P=0.00)的组间差异有统计学意义。O组左侧肺组织的TNF-α含量较T组明显升高(37.11±4.03pg/ml vs 19.47±4.30pg/ml,P =0.00),O组右侧肺组织的TNF-α含量较T组稍有升高(30.39± 1.83pg/mlvs18.38±1.66pg/ml,P=0.00)。O组内左右肺比较,O组萎陷侧肺较通气侧肺的 TNF-α含量明显增加(37.11 ±4.03pg/ml vs 30.39± 1.83pg/ml,P=0.04),差异有统计学意义(t=2.749,P<0.05)。T组内左右肺比较,TNF-α的含量差异无统计学意义(t=0.613,P=0.57)。相比两组,左侧肺组织的IL-6含量(t=-12.063,P=0.00)及右侧肺组织的IL-6含量(t=-14.753,P=0.00)的组间差异有统计学意义。O组左侧肺组织的IL-6含量较 T组显著升高(20.2±1.33pg/mlvs7.97±1.98pg/ml,P=0.00),O 组右侧肺组织的IL-6含量较T组稍有升高(15.94± 1.00pg/ml vs 8.38±0.56pg/ml,P=0.00)。O组内左右肺比较,O组萎陷侧肺较通气侧肺的IL-6含量明显增加(20.82±1.33pg/ml vs 15.94±1.00pg/ml,P=0.35),差异有统计学意义(t=-0.408,P<0.05)。T组内左右肺比较,IL-6的含量差异无统计学意义(t=38.243,P=0.00)。4.肺组织病理学变化:大体标本可见T组肺组织基本正常,肺表面未见明显出血灶;O组右侧肺组织无明显损伤表现,左侧肺组织表面大部分呈深红色,可见明显出血灶。光镜下T组双侧肺组织均无明显间质性水肿、无肺泡水肿、中性粒细胞浸润,肺泡内有轻微红细胞渗出;O组通气侧肺组织有轻度病理损伤改变,萎陷侧肺组织可见肺泡萎缩,中度间质性水肿、中度肺泡水肿、中度中性粒细胞浸润、重度肺泡内红细胞渗出。左侧肺组织病理评分(t=-25.913,P=0.00)及右侧肺组织病理评分(t=-6.351,P=0.00)的组间差异有统计学意义。O组左侧肺组织病理评分较T组显著增高(9.40±1.55vs1.20±1.45,P=0.00),O组右侧肺组织病理评分较T组稍有增高(3.00± 1.12 vs 1.40± 1.54,P=0.00)。O组左右肺比较,差异有统计学意义(t=29.000,P<0.05),萎陷侧肺组织病理评分较通气侧明显增高(9.40±1.55vs3.00± 1.12,P=0.00);T组内左右肺病理评分比较差异无统计学意义(t=-1.000,P=0.37)。5.氧合指数:O组在不同时间点间OI有统计学差异(F=217.308,P=0.00)。O组在T1、T2时间点的OI与T0、T3时间点比较明显降低(105.8±28.38mmHg、143.80± 64.09mmHg vs 487.14±21.48mmHg、478.20±22.65mmHg,P<0.05),T组在各个时间点OI无明显差异(F=1.074,P=0.38)。组间比较,O组在T1、T2 时间点较 T 组 OI 明显降低(105.8±28.38mmHg、143.80±64.09mmHg vs 499.00± 12.65mmHg、494.00 ±7.42mmHg,P=0.00)。6.依据肺组织病理损伤评分、OI值及肺组织中TNF-α、IL-6含量等指标综合分析,O组兔均达到单侧肺通气肺损伤标准。结论:兔行单侧肺通气2h、双肺通气0.5h后,双侧肺组织中TNF-a及IL-6的含量增高,W/D比值增加,肺损伤病理评分增加,以萎陷侧肺中表现为著,OI值降低,说明肺脏在形态及功能上均发生了比较明显的损伤,可以作为单侧肺通气肺损伤动物模型。第二部分内皮素-1受体拮抗剂对兔单侧肺通气时肺损伤的保护作用目的:观察内皮素-1受体拮抗剂对兔单侧肺通气时肺损伤的保护作用方法:1.实验动物及分组:15只清洁级健康日本大耳白兔,随机分为3组,每组5只,即双肺通气组(T组)、单肺通气组(O组)、单肺通气+BQ-123组(OB组)。2.兔单侧肺通气肺损伤模型的建立:模型制作方法同第一部分。3.检测指标:(1)留取双肺下叶背段肺组织测肺组织中SOD活性。(2)取双肺下叶外基底段,匀浆并取上清液,用ELISA法测肺组织TNF-α、IL-6含量。(3)取双侧上叶肺组织测量其湿重及干重,计算肺组织湿/干(W/D)比值。(4):取双肺下叶内基底段肺组织包埋切片,用普通光学显微镜观察并进行肺损伤评分。(5)于T0、T1、T2及T3时间点分别抽动脉血,行动脉血气分析,根据血气分析计算氧合指数(Oxygenationindex,OI)。4.统计学方法:应用SPSS 20.0统计软件分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,若为计数资料时,采用X2检验,组间数据比较采用重复测量单因素方差分析,组内左右肺比较采用配对t检验,P<0.05认为有统计学意义。结果:1.肺组织W/D比值变化T 组、O 组及 OB 组之间比较,左(F=102.168,P =0.00)、右(F=32.755,P=0.00)两侧肺组织W/D比值的组间差异有统计学意义。OB组左侧肺组织的W/D比值较T组升高(4.53±0.18vs 3.93±0.19,P<0.05),但低于O组(5.55±0.17,P<0.05);OB组右侧肺组织的W/D比值也较T组升高(4.16±0.14 vs 3.76±0.23,P<0.05),但低于O组(4.76±0.21,P<0.05)。组内左右肺比较,T组内双侧肺之间W/D值无明显差异(t =1.051,P =0.35),O组(t =-40.570,=0.00)及OB组(t=3.139,P=0.03)组内左右肺比较差异有统计学意义,且萎陷侧肺较通气侧肺的W/D比值明显增加(P<0.05)。2.肺组织SOD活性T 组、O 组及 OB 组之间比较,左(F=36.931,P=0.00)、右(F=55.815,P=0.00)两侧肺组织SOD活性的组间差异有统计学意义。OB组左侧肺组织的SOD活性较 T 组降低(78.29±1.78U/mgvs84.42±6.77U/mg,P<0.05),但高于 O组(62.21 ±2.10U/mg,P<0.05);OB组右侧肺组织的SOD活性也较T组降低(82.67± 1.54U/mg vs 86.98± 1.74U/mg,P<0.05),但仍高于 O 组(74.21 ±2.44U/mg,P<0.05)。组内左右肺比较,T组内双侧肺中SOD活性无明显差异(t=-0.852,P=0.44),O 组(t=-7.967,P=0.00)及 OB 组(t=-3.043,P=0.04)的左右肺比较差异有统计学意义,且萎陷侧肺较通气侧肺的SOD活性明显降低(P<0.05)。3.肺组织TNF-α、IL-6含量T组、O 组及 OB 组之间比较,左(F=24.412,P=0.00)、右(F=71.003,P=0.00)两侧肺组织中TNF-α含量的组间差异有统计学意义。OB组左侧肺组织的TNF-α含量较 T 组明显增高(26.30±2.18pg/mlvs19.47±4.30pg/ml,P<0.05),但低于O组(37.11±3.03pg/ml,P<0.05);OB组右侧肺组织的TNF-α含量也较 T 组增高(23.12±1.27pg/mlvs18.38±1.66pg/ml,P<0.05),但仍低于 O 组(30.39±1.83pg/ml,P<0.05)。组内左右肺比较,T组内双侧肺中TNF-α含量无明显差异(t=0.613,P=0.57),O 组(t=2.749,P<0.05)及 OB 组(t=3.293,P=0.03)的左右肺比较差异有统计学意义,且萎陷侧肺较通气侧肺的TNF-α含量明显增高(P<0.05)。T组、O 组及 OB 组之间比较,左(F=85.265,P=0.00)、右(F=104.307,P=0.00)两侧肺组织中IL-6含量的组间差异有统计学意义。OB组左侧肺组织的 IL-6 含量较 T 组明显增高(14.13± 1.26pg/mlvs7.97±1.98pg/ml,P<0.05),但低于O组(20.82± 1.33pg/ml,P<0.05);OB组右侧肺组织的IL-6含量也较T 组增高(11.09±0.89pg/ml vs 8.38±0.56pg/ml,P<0.05),但仍低于 O 组(15.94± 1.OOpg/ml,P<0.05)。组内左右肺比较,T组内双侧肺中IL-6含量无明显差异(t=-0.408,P=0.70),O组(t=5.357,P<0.01)及OB组(t=4.163,P<0.05)左右肺比较差异有统计学意义,且萎陷侧肺较通气侧肺的IL-6含量明显增高(P<0.05)。4.肺组织病理学变化:大体标本可见T组肺组织基本正常,肺表面未见出血灶;O组右侧肺组织局部可见少量出血灶,左侧肺组织表面大部分呈深红色,可见明显出血灶。OB组双侧肺损伤程度介于T组与O组之间。光镜下T组双侧肺组织无明显间质性水肿、无肺泡水肿、中性粒细胞浸润,肺泡内间轻微红细胞渗出。O组通气侧肺组织有轻度损伤,萎陷侧肺组织可见肺泡萎缩,中度间质性水肿、中度肺泡水肿、中度中性粒细胞浸润、重度肺泡内红细胞渗出。OB组损伤程度介于T组与O组之间。左(F=140.112,P=0.00)及右(F=20.222,P=0.00)两侧肺组织病理评分组间差异有统计学意义。OB组左侧肺组织的病理评分较T组显著增高(5.40±1.14vs1.20±0.45,P<0.05),但低于O组(9.40±0.55,P<0.05);OB组右侧肺组织的病理评分也较T组稍有增高(2.40±0.48vs1.40±0.48,P<0.05),但仍低于 O组(3.60±0.47,P<0.05)。组内左右肺比较,T组内双侧肺的病理评分无明显差异(t=-1.000,P=0.37),O组(t=29.000,P<0.01)及 OB 组(t=6.708,P<0.01)的左右肺比较差异有统计学意义,且萎陷侧肺较通气侧肺的病理评分明显增高(P<0.05)。5.氧合指数OB组在不同时间点间OI有统计学差异(F=97.293,P=0.00),OB组在T1、T2时间点的OI与T0、T3时间点比较明显降低(117.20±41.63mmHg、186.60±70.31mmHgvs478.80± 24.04mmHg、471.80±48.56mmHg,P<0.05)。T组在各个时间点OI无明显差异(F=1.074,P=0.39)。O组在不同时间点间OI有统计学差异(F=217.308,P=0.00),O组在T1、T2时间点的OI与T0、T3时间点比较明显降低(105.80 ± 28.38mmHg、143.80 ± 64.09mmHg vs 487.14 ±21.48mmHg、478.20±22.65mmHg,P<0.05)。组间比较,OB 组与 T 组在各个时间点上差异有统计学意义(P<0.05),OB组在T1、T2时间点较T组OI明显降低(117.20±41.63mmHg、186.60±70.31mmHgvs499.00± 12.65mmHg、494.00 ±7.42mmHg,P<0.05),OB组与O组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在兔单肺通气前予以BQ-123干预后,两侧肺组织SOD活性增强、湿干比降低、炎症因子如TNF-α、IL-6含量降低、病理评分减少,以萎陷侧变化为著,说明内皮素-1受体拮抗剂可减轻兔单侧肺通气引起的肺损伤,对兔单肺通气肺损伤有保护作用。第三部分内皮素-1受体拮抗剂对兔单侧肺通气时PI3K-Akt-HIF-1α信号通路的影响目的:探讨PI3K-Akt-HIF-1α信号通路是否参与了内皮素-1受体拮抗剂减轻兔单侧肺通气肺损伤的过程及其对单侧肺通气肺损伤的影响。方法:1.实验动物及分组:清洁级健康日本大耳白兔20只,体重2.5±0.3kg,随机分为四组(n=5):双肺通气组(T组)、单肺通气组(O组)、单肺通气+BQ-123组(OB组)和单肺通气+BQ-123+PI3K的特异性抑制剂LY294002组(OBL组)。OB组和OBL组在单肺通气前经股静脉注射BQ-123(50ug/kg);OBL组给与BQ-123前静脉输注LY294002 0.3mg/kg,输注时间为5min,其余3组在同时间点输注等量的生理盐水。T组维持双肺通气2.5h,其余组右侧单肺通气2h后恢复双肺通气0.5h。2.兔单侧肺通气肺损伤模型的建立:模型制作方法同第一部分。3.检测指标及方法:留取左上肺检测肺组织湿干比(W/D),取左下肺部分组织行病理切片,采用普通光学显微镜观察进行肺损伤评分,用Western blot法检测左下肺组织的磷酸化Akt(p-Akt)和HIF-1α表达水平。4.统计学方法:应用SPSS 20.0统计软件分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.左侧肺组织W/D比值变化T组、O组、OB组及OBL之间比较,左侧肺组织W/D的组间差异有统计学意义(F=59.768,P=0.00)。OBL组肺组织的W/D比值较OB组升高(5.00±0.25vs4.53±0.18,P<0.05),但低于O组(5.55±0.17,P<0.05)。2.肺组织病理评分T组、O组、OB组及OBL组之间比较,左侧肺组织病理评分的组间差异有统计学意义(F =110.571,P=0.00);OBL组肺组织的病理评分较OB组升高(6.60±0.55vs5.40±1.14,P<0.05),但低于 O组(9.40±0.55,P<0.05)。3.肺组织p-Akt和HIF-1α表达水平O 组(0.136±0.038)、OB 组(0.476±0.081)、OBL 组(0.247±0.058)左侧肺组织p-Akt表达水平较T组(0.639± 0.063)显著下调,且OBL组的p-Akt表达水平低于OB组,高于O组。OB组与O组、OBL组之间比较差异有统计学意义(P值均小于0.05)。O 组(0.076±0.016)、OB 组(0.281±0.062)、OBL 组(0.129±0.051)左侧肺组织HIF-1α表达水平较T组(0.569±0.124)显著下调,且OBL组的HIF-1α表达水平低于OB组,高于O组。OB组与O组、OBL组之间比较差异有统计学意义(P值均小于0.05)。结论:在内皮素-1受体拮抗剂BQ-123干预后,兔非通气侧肺组织中p-Akt及HIF-1α的表达均上调,肺水肿程度减轻、肺损伤评分降低,说明内皮素-1受体拮抗剂可促进p-Akt及HIF-1α的表达,从而减轻单侧肺通气肺损伤;在此基础上加用PI3K的特异性抑制剂LY294002后,兔非通气侧肺组织中p-Akt及HIF-1α的表达下调,肺水肿程度加重、肺损伤评分升高,说明PI3K-Akt-HIF-1α信号通路的激活可减轻单侧肺通气肺损伤。然而,内皮素-1受体拮抗剂如何激活PI3K-Akt-HIF-1α信号通路尚需进一步研究。