【摘 要】
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对四川与重庆地区送检的病鹅进行病原检测,通过细菌培养和PCR检测排除了细菌和常见病毒（鹅细小病毒、鹅圆环病毒、鹅星状病毒、鹅冠状病毒、鹅副粘病毒和禽流感病毒）感染。随后将研磨病料的上清过滤并接种健康鹅胚,盲传10代,以此分离未知病原。对盲传尿囊液进行病毒DNA与RNA核酸抽提,并将核酸送深圳华大基因科技服务有限公司进行病毒全基因组从头测序（de novo sequencing）,发现了一种新RNA
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对四川与重庆地区送检的病鹅进行病原检测,通过细菌培养和PCR检测排除了细菌和常见病毒（鹅细小病毒、鹅圆环病毒、鹅星状病毒、鹅冠状病毒、鹅副粘病毒和禽流感病毒）感染。随后将研磨病料的上清过滤并接种健康鹅胚,盲传10代,以此分离未知病原。对盲传尿囊液进行病毒DNA与RNA核酸抽提,并将核酸送深圳华大基因科技服务有限公司进行病毒全基因组从头测序（de novo sequencing）,发现了一种新RNA病毒。利用NCBI Genbank比对病毒序列和基因组结构并分析系统发育关系,明确该病毒属于黄病毒科的Pegivirus属,且不同于现有的11个病毒种Pegivirus A～K,将其命名为鹅pegivirus（Goose pegivirus,GPgV）。病毒在川渝地区的流行病学调查:基于GPgV保守的NS3基因建立了病毒荧光定量RT-PCR和巢式RT-PCR方法,分别应用于病毒核酸定量检测和临床样品感染率检测。2018～2019年川渝地区部分鹅场的雏鹅病毒性疾病的流行病学调查显示,发病雏鹅感染包括GPgV、鹅细小病毒、鹅圆环病毒和鹅星状病毒,病毒总阳性检出率达到85.7%。其中,GPgV阳性率检出率最高（44.9%）,并呈现高度的混合感染（36.8%）,主要混合感染鹅细小病毒和鹅圆环病毒。病毒的人工感染试验:24只3日龄雏鹅经静脉注射接种GPgV感染的鹅胚尿囊液,隔离饲养30天,每三天称量一次雏鹅体重。相比对照组,在第19、22和25天感染组雏鹅表现出明显的生长迟缓症状。感染组雏鹅分别在第8天和第18天死亡一只;第30天剖检剩余22只雏鹅,有9只观察到胸腺充血肿大,有6只观察到脾脏肿大。荧光定量RT-PCR检测显示第8天死亡的雏鹅为GPgV阴性,GPgV广泛分布在在胸腺、脾脏、肝脏、胰腺、十二指肠、直肠和法氏囊等组织,并且在脾脏和胸腺中病毒含量最高。基于鼠抗GPgV E2单克隆抗体为一抗的免疫组织化学检测显示,脾脏和胸腺中均有明显病原阳性信号。病毒的体外增殖情况:GPgV在9日龄鹅胚中盲传10代,鹅胚死亡发生在感染后59～174 h,死亡率在0～66.7%不等。第11～14代鹅胚尿囊液中的平均病毒基因组拷贝数随传代呈上升趋势,拷贝数范围在2.53×106～1.13×1010 copies/m L。在第14代中观察到,24～120 h尿囊液中的平均病毒基因组拷贝数呈下降趋势,120～192 h拷贝数逐渐增加。将第12代GPgV鹅胚尿液接种鹅胚成纤维细胞（Goose embryo fibroblasts,GEFs）并传代8代。GPgV对GEFs没有细胞毒性,没有观察到细胞病变。病毒基因组拷贝数随传代增加,拷贝数范围在2.02×107～3.78×108 copies/m L。以鼠抗GPgV E2单克隆抗体为一抗进行间接免疫荧光检测,可观察到GPgV在GEF增殖的绿色荧光阳性信号。GPgV在GEFs上的生长曲线显示:在细胞中,病毒基因组拷贝数随时间逐渐增加,在72～168 h达到平台期;在细胞培养上清中,前48 h病毒基因组拷贝数无明显变化,48～120 h病毒基因组拷贝数迅速增加,120～168 h达到平台期,随后逐渐下降。同时,GPgV在9日龄鸭胚、鸭胚成纤维细胞、仓鼠肾细胞、蝙蝠肺细胞、分离的鹅外周血淋巴细胞和脾脏淋巴细胞中均无法有效增殖。综上,本实验分离鉴定了第一个非哺乳动物pegivirus即GPgV,通过人工感染试验认为GPgV可能是导致川渝地区雏鹅免疫损伤的病原体或病原体之一。对2018～2019年川渝地区雏鹅GPgV及其它主要病毒的流行进行了调查。明确了GPgV人工感染雏鹅的临床病理变化和病毒组织分布,以及病毒体外增殖特性,为进一步研究GPgV的致病机制奠定了基础。
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