猪圆环病毒血清 3 型（Porcine circonvirus serotype 3,PCV3）于2015年首次在美国北卡罗来纳州的一个农场中被发现,该病毒主要引起猪的生殖障碍,呼吸障碍等多系统的炎症,临床表现消瘦、呼吸困难、皮炎和肾病综合征、流产等。目前,美国、加拿大、波兰和韩国等国通过流行病学调查,证实了 PCV3的普遍存在;在国内,该病毒在中东部如江西、广州、福建、安徽和河南等省份相继被报道发生流行。该病已经引起了养猪行业的高度关注。PCV3和PCV2 Cap蛋白的同源性极低,且两者不具有交叉免疫保护。现有的商品化PCV2疫苗和ELISA检测试剂盒,都无法为猪提供针对PCV3的有效免疫保护和准确检测工作。因此,建立一种针对PCV3的血清学检测方法,可为该病毒血清学调查及病原学研究奠定一定的基础。作为单链环状DNA的PCV3,其ORF2基因编码的Cap蛋白是其主要的具有抗原性的结构蛋白,与病毒诱导的中和抗体形成相关。本试验根据NCBI GenBank上提供的PCV3 ORF2基因序列,通过分析主要抗原位点和稀有密码子分布情况,设计特异性引物,分别在上、下游引物前加入BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点,并PCR扩增目的基因。选择原核表达载体pET-32a,利用T4 DNA连接酶,把目的基因克隆到pET-32a上,构建重组表达载体pET-32a-PCV3 cap,并将其转染至DH5 α感受态细胞。提取重组质粒,经PCR鉴定、酶切鉴定以及测序鉴定,证实重组质粒结构完整及成功构建后,将重组表达质粒转染入trans 1-t1感受态细胞中。优化诱导条件,SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定表达产物。PCR鉴定结果表明,使用通用引物T7和目的基因引物进行交叉PCR鉴定时,PCR产物大小分别为1204bp、641bp、1094 bp和531bp,与预计的大小一致,表明Cap基因插入到表达质粒的对应位置;利用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切鉴定和测序鉴定表明,重组表达载体pET-32a-PCV3cap构建成功。最佳诱导条件的筛选结果表明:37℃条件下,摇菌约需4-6h（至D600=0.8）,IPTG的最佳浓度为1.5 mmol/L,培养8h,表达目的蛋白最多。收集表达菌利用超声波破碎,经Ni-NTA亲和层析柱纯化,流出液进行SDS-PAGE分析,结果显示400mmoL/L咪唑浓度的洗脱液洗脱效率最高;进一步Western-blot鉴定,证明PCV3 Cap蛋白正确表达,Cap蛋白分子量约为40ku,具有良好的反应原性。利用原核表达并纯化的产物Cap蛋白作为包被抗原,包被酶标板,建立检测PCV3的间接ELISA检测方法。对最佳包被抗原浓度,一抗浓度,二抗浓度,封闭液进行最佳工作条件的优化筛选。计算间接ELISA方法的临界值,并对所建立方法的特异性和重复性进行验证。最后用该方法对来自福建省猪场的317份血清样品进行检测。结果表明最佳包被抗原浓度为0.009mg/mL,4℃包被过夜,待检血清最佳稀释度为1:400,5%BSA为最佳封闭液,37℃封闭1h,酶标抗体最佳稀释倍数为1:4000,酶标二抗体最佳作用时间为0.5h,底物液作用最佳时间为15min,临界值为0.3500。特异性试验结果表明,该方法只和PCV3阳性血清反应,而与猪口蹄疫病毒（PMDV）、猪乙脑病毒（JEV）、猪伪狂犬病毒（PRV）与猪圆环病毒2型（PCV2）病毒阳性血清均无交叉反应。用建立的间接ELISA方法对福建省福州市、南平市、龙岩市、漳州市、莆田市周边地区猪场进行PCV3抗体检测,检测结果表明,阳性血清数达91份,总体阳性率为28.71%。综上所述,本试验利用原核表达体系,成功构建重组表达载体pET-32a-PCV3 cap,并利用重组的蛋白建立了临床检测PCV3抗体的间接ELISA方法,且该方法具有灵敏性高、特异性强的特点。为猪圆病毒3型流行病学的调查和血清学检测试剂盒的开发提供了一定的技术基础。