背景胃溃疡病(Gastric Ulcer, GU)是常见的消化系统疾病,由胃液对胃黏膜自身消化所形成的溃疡样病变。GU发病机制复杂,现代医学认为该病是致溃疡的攻击因子与保护胃黏膜的防御因子失衡所致。其主要病因包括：胃酸与胃蛋白酶作用,幽门螺杆菌(H. pylori, Hp)感染,非甾体抗炎药(NSAID)使用,胃十二指肠动力异常,应激及遗传因素影响等,其中胃酸、蛋白酶、Hp对GU的发病起主导作用。近年来,由于组胺-2受体拮抗剂(H2RA)、质子泵抑制剂(PPI)与Hp根除方案的广泛使用,GU容易达到近期治愈效果,但停药后其复发率高,这与溃疡愈合质量(QOUH)不高有关。中医学认为胃溃疡属“胃脘痛”范畴,其发生与情绪、饮食所伤、脾胃虚弱等密切相关。中医治疗GU重在辨证施治,通过中药的综合作用机制,显著提高胃溃疡的QOUH,降低溃疡复发率。维胃方(WWF)是临床治疗胃溃疡的经验方。前期的实验研究表明,维胃方可调节乙酸性胃溃疡大鼠血清胃泌素(GAS)、血浆神经降压素(NT)、表皮生长因子(EGF)、白介素-2(IL-2)、一氧化氮(N0)的水平及诱生型一氧化氮合酶(iNOS)的活性,提高胃黏膜中氨基己糖的含量,从而减轻胃黏膜损伤,增强胃黏膜屏障,有效促进胃溃疡愈合。大鼠乙酸性胃溃疡模型是经典的胃溃疡模型,其白愈时间长且愈合后容易复发的特点及其病理特征与人类慢性胃溃疡的特点十分相似,现已广泛用于抗溃疡药物的药效与作用机制研究,但该模型的发生与自愈机制仍不甚明确。另外,运用该模型评价抗胃溃疡中药时,往往选择单一指标或若干个指标进行,不能系统反映中药多靶点综合作用的特点。代谢组学(Metabonomics)是继基因组学、转录组学和蛋白质组学后的一种新的生物组学技术。它运用系统研究手段,分析生物体受病理生理或基因变异等刺激或药物作用后,其整体内源性小分子代谢物质的动态应答变化；再运用模式识别技术,寻找表征特定状态的生物标志物,分析不同状态的代谢网络缺陷或干预措施对代谢网络的影响,从而揭示特定状态的生物学本质及干预措施的机制。由于代谢组学有全局性和动态性的特点,与中医的整体观相符,可系统而全面地揭示中医证候实质与中药药理、毒理及其机制,因此该技术已逐渐应用于中医药研究领域。目的1、观察大鼠乙酸性胃溃疡发生与自愈过程中胃溃疡面积与组织病理的动态变化；观察WWF对大鼠乙酸性胃溃疡面积及组织病理的影响。2、运用代谢组学技术探讨大鼠乙酸性胃溃疡发生与自愈过程生物学特征的动态变化,并寻找表征这一过程的生物标志物,根据标志物的变化整体阐释慢性胃溃疡的发生与自愈机制,为全面评价抗胃溃疡药物提供实验依据。3、从代谢组学角度评价WWF对大鼠乙酸性胃溃疡的治疗效果；根据WWF对胃溃疡生物标志物的影响,从系统与整体层面探讨WWF的作用机制。方法1、SPF级Wistar雄性大鼠完全随机分为正常组、模型1天组、模型3天组、模型7天组、模型10天组(自愈组)、维胃方高、中、低剂量组与雷尼替丁组(治疗对照组),每组8只。采用冰醋酸灼烧大鼠胃窦前壁浆膜层制备胃溃疡模型。测量不同时间模型组及治疗组的胃溃疡面积,制备病理组织切片,HE染色。2、收集各组大鼠胃黏膜及12h尿液,胃黏膜制备匀浆后进行衍生化,尿液直接衍生化；采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)测定各组大鼠的胃黏膜与尿液的代谢物谱。运用GC-MC工作站对代谢物谱进行峰面积积分,峰判别与对齐,扣除溶剂峰与杂质峰,挑选共有峰进行归一化处理,得到由共有峰号、样品号及归一化后的峰强度组成的矩阵,将其导入模式识别软件SIMCA-P+12.0(瑞典,Umetrics AB, Umea)进行标准化处理,行主成分分析(PCA)与偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)。PCA直观观察不同时间模型组的动态变化及药物治疗效果；PLS-DA进一步考察组间的区分程度,并根据各代谢物的投影重要性(VIP)评价不同物质与分类的相关性程度,以VIP值>1的代谢物作为潜在生物标志物。运用SPSS13.0软件对不同组潜在生物标志物水平的差异进行单维统计分析,选择差异有统计学意义的物质作为最终的生物标志物。根据大鼠乙酸性胃溃疡不同时间模型组生物标志物水平的变化,结合现有的生物化学知识与研究阐释胃溃疡发生与自愈机制；根据维胃方对胃溃疡生物标志物的影响,探讨WWF治疗胃溃疡的疗效机制。3、计量资料以均数士标准差(x±s)表示,两组均数比较采用独立样本T检验；多组均数比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),若方差齐性,采用LSD法多重比较；若方差不齐,则Welch法校正后采用Games-Howell法多重比较；所有检验水平a=0.05(双侧)。结果1、胃黏膜标本大体观察：正常组大鼠胃黏膜光滑完整,色淡红,未见充血水肿、糜烂出血；模型1天组胃窦前壁隐约可见一直径2～5mm的缺损状病灶,周围充血水肿；3天组形成直径5～6mm的明显溃疡,中心凹陷,覆盖灰白色或黄白色苔状物,边界清楚,周围堤状,水肿明显；模型7天组、10天组溃疡面稍缩小,周围苍白色瘢痕组织增生形成皱壁。WWF中剂量组溃疡修复良好,无苔,皱襞平滑向中心集中；WWF高、低剂量组溃疡明显缩小,薄白苔覆盖,周围炎症消退,皱襞集中；雷尼替丁组基本同WWF高、低剂量组。2、溃疡面积比较：不同时间模型组与治疗组的胃溃疡面积(S)方差分析结果组显示间总体均数有显著性差异(P<0.01)。多重比较结果显示,模型3天组S显著大于模型1天组(P<0.05)；模型7天组胃溃疡与模型3天组比较,S显著减少(P<0.05)；模型10天组(自愈组)与模型3天组比较差异有统计学意义(P<0.01)。与模型3天组及自愈组比较,各用药组的S显著减小(P<0.01)；维胃方中剂量组S显著小于雷尼替丁组(P<0.05),而维胃方高、低剂量组与雷尼替丁组S无显著性差异(P>0.05)。3、病理变化：正常组：黏膜层光滑完整,腺细胞排列均匀,黏膜下层、肌层、浆膜层完好。模型1天组：黏膜出现缺损,部分腺体被破坏；黏膜下层毛细血管血流瘀滞；黏膜下层及浆膜层被大量炎性细胞浸润。模型3天组：黏膜缺损大,腺体完全被破坏、消失；黏膜下层毛细血管内除有血流瘀滞外,部分毛细血管破裂、出血,黏膜下层、浆膜层仍有大量炎性细胞浸润。模型7天组：黏膜缺损达肌层,出现少量紊乱排列的再生腺细胞,黏膜下层有一定量的炎性细胞浸润,毛细血管内血栓存在；自愈组：部分黏膜缺损达肌层,再生腺细胞排列紊乱；黏膜下层有炎细胞浸润,见明显血栓。雷尼替丁组：缺损较小,表面见新生上皮细胞及腺细胞,排列致密不整齐；黏膜下层有炎细胞浸润,肌层有瘢痕纤维形成。维胃方组高、低剂量组：缺损减小,再生腺细胞密度不匀,黏膜下层炎细胞浸润,其中高剂量组增生的腺细胞数量较多,黏膜下血管未见明显病理改变。维胃方中剂量组：黏膜基本完整,腺体细胞增生数量较多,排列较整齐；黏膜下层仅见少量炎性细胞浸润。4、各时间模型组的胃黏膜生物标志物及其变化：模型1天组的生物标志物中胆甾醇、硬脂酸、花生四烯酸、油酸、亚油酸、软脂酸、乳酸、苹果酸与烟酰胺水平显著高于正常组(P<0.01),赖氨酸、焦谷氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酸、丙氨酸、组氨酸、甘氨酸、蛋氨酸与缬氨酸水平显著低于正常组(P<0.01)。模型3天组的生物标志物中花生四烯酸、胆甾醇、油酸、软脂酸、硬脂酸、苹果酸、乳酸与亚油酸水平显著高于正常组(P<0.01),赖氨酸、酪氨酸、焦谷氨酸、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸与丙氨酸水平显著低于正常组(P<0.01)。模型7天组的生物标志物中花生四烯酸、胆甾醇、软脂酸、亚油酸、硬脂酸、烟酰胺、苹果酸、油酸、乳酸、谷氨酰胺、色氨酸与a-羟基苯乙酸水平显著高于正常组(P<0.01),酪氨酸、谷氨酸、脯氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、焦谷氨酸、组氨酸与苯丙氨酸水平显著低于正常组(P<0.01)。模型10天组的生物标志物中花生四烯酸、异亮氨酸、天冬氨酸、苹果酸、半胱氨酸、胆甾醇、乳酸、3-甲基胞嘧啶与缬氨酸水平显著高于正常组(P<0.01),脯氨酸、硬脂酸、油酸、谷氨酸、软脂酸、二甲基甘氨酸、赖氨酸、亚油酸与酪氨酸水平显著低于正常组(P<0.01)。5、表征大鼠胃溃疡发生与自愈动态过程的胃黏膜生物标志物包括：花生四烯酸、苹果酸、异亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、乳酸、蛋氨酸、谷氨酸、酪氨酸、胆甾醇、赖氨酸、油酸、焦谷氨酸、硬脂酸、组氨酸与软脂酸。这些胃黏膜标志物在胃溃疡的不同阶段呈动态变化。6、各时间模型组尿液生物标志物及其变化：模型1天组的生物标志物中柠檬酸、马尿酸、乌头酸、琥珀酸、5-乙酰胺基戊酸、吲哚乙酸与异柠檬酸水平显著高于正常组(P<0.01),苯乙尿酸、3-丁酮酸、对羟基苯乙酸、3-羟基己酸、3-羟基丁酸与脯氨酸水平显著低于正常组(P<0.01)。模型3天组的生物标志物中苯乙尿酸、对羟基苯乙酸、5-乙酰胺基戊酸、苯乙酸、酪胺与丙二酸水平显著高于正常组(P<0.01或P<0.05),柠檬酸、马尿酸、乌头酸、琥珀酸、吲哚乙酸、异柠檬酸与喹哪啶酸水平显著低于正常组(P<0.01)。模型7天组的生物标志物中苯乙尿酸、5-乙酰胺基戊酸、3-羟基丁酸、对羟基苯乙酸、苯乙酸与苯甲酸水平显著高于正常组(P<0.01或P<0.05),马尿酸、柠檬酸、琥珀酸、喹哪啶酸、甘氨酸、3-甲氧基苯基丙酸、甲基丙二酸、吲哚乙酸与异柠檬酸水平显著低于正常组(P<0.01或P<0.05)。模型10天组的生物标志物中苯乙尿酸、5-乙酰胺基戊酸、对羟基苯乙酸与吲哚乙酸水平显著高于正常组(P<0.01或P<0.05),柠檬酸、乌头酸、喹哪啶酸、3-甲氧苯基丙酸、琥珀酸与甘氨酸水平显著低于正常组(P<0.01或P<0.05)。7、表征大鼠胃溃疡发生与自愈动态过程的尿液生物标志物包括：苯乙尿酸、5-乙酰胺基戊酸、柠檬酸、马尿酸、乌头酸、3-羟基己酸、3-丁酮酸、甘氨酸、喹哪啶酸、琥珀酸、对羟基苯乙酸、庚二酸、脯氨酸、吲哚乙酸与苯乙酸。这些尿液标志物在胃溃疡的不同阶段呈动态变化。8、治疗组胃黏膜生物标志物及其变化：表征雷尼替丁组与正常组差异的生物标志物中花生四烯酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、乳酸、色氨酸、异亮氨酸、苹果酸与天冬氨酸水平显著高于正常组(P<0.01),胆甾醇、酪氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、油酸、焦谷氨酸、赖氨酸、软脂酸与硬脂酸水平显著低于正常组(P<0.01或P<0.05)。表征WWF高剂量组与正常组差异的生物标志物中嘧啶酮、亮氨酸、3-乙酰胺基丙醛与赖氨酸水平显著高于正常组(P<0.01或P<0.05),酪氨酸、羟脯氨酸、油酸、甘氨酸、丙氨酸与花生四烯酸水平显著低于正常组(P<0.01或P<0.05)。表征WWF中剂量组与正常组的差异的生物标志物中谷氨酸、组氨酸、亮氨酸与赖氨酸水平显著高于正常组(P<0.05),酪氨酸与脯氨酸水平显著低于正常组(P<0.01或P<0.05)。表征WWF低剂量组与正常组的生物标志物中3-乙酰胺基丙醛、赖氨酸、亮氨酸、嘧啶酮与烟酰胺水平显著高于正常组(P<0.01或P<0.05),酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、焦谷氨酸与缬氨酸水平显著低于正常组(P<0.01或P<0.05)。不同药物对胃黏膜胃溃疡标志物有不同程度的回调,以中剂量WWF为佳。9、治疗组尿液生物标志物及其变化：表征雷尼替丁组与正常组差异的生物标志物中苯乙尿酸、酪胺、对羟基苯乙酸与苯乙酸水平显著高于正常组(P<0.01),柠檬酸、5-乙酰胺基戊酸、喹哪啶酸、琥珀酸、吲哚乙酸、乙基丙二酸与苹果酸水平显著低于正常组(P<0.01)。表征WWF高剂量组与正常组差异的生物标志物中苯乙尿酸与脯氨酸水平显著高于正常组(P<0.05),柠檬酸、乌头酸、3-甲氧苯基丙酸、吲哚乙酸、琥珀酸、高柠檬酸、喹哪啶酸与α-酮戊二酸水平显著低于正常组(P<0.01或P<0.05)。表征WWF中剂量组与正常组差异的生物标志物中脯氨酸与3-羟基苯乙酸水平显著高于正常组(P<0.01),3-甲氧苯基丙酸、吲哚乙酸与高柠檬酸水平显著低于正常组(P<0.01或P<0.05)。表征WWF低剂量组与正常组差异的生物标志物中苯乙尿酸、乙基丙二酸、酪胺与脯氨酸水平显著高于正常组(P<0.01或P<0.05),柠檬酸、乌头酸、吲哚乙酸、3-甲氧苯基丙酸、琥珀酸、喹哪啶酸、天冬氨酸与高柠檬酸水平显著低于正常组(P<0.0l或P<0.05)。不同药物对尿液胃溃疡标志物有不同程度的回调,以中剂量WWF为佳。结论1、大鼠乙酸性胃溃疡不同时间模型组胃黏膜的大体观察与胃溃疡面积比较表明：模型1天组处于溃疡发生阶段,模型3天组处于溃疡完全形成阶段,模型7天组、10天组处于不同的愈合阶段,但自愈效果不理想。组织病理表明：大鼠乙酸性胃溃疡形成与胃黏膜的炎症损伤及微循环障碍密切相关；自愈机制下修复的胃黏膜再生组织结构异常,是溃疡易于复发的组织学基础。2、治疗组胃黏膜标本的大体观察与溃疡面积比较表明：WWF中剂量组胃溃疡愈合效果最佳,而WWF高、低剂量组愈合较差,与雷尼替丁组类似,但优于自愈组。组织病理表明：WWF中剂量组的再生组织结构更接近正常组织。3、运用基于GC-MS的代谢组学技术,揭示了大鼠乙酸性胃溃疡发生与自愈过程胃黏膜与尿液代谢物谱的动态变化,获得了表征其生物学特征的代谢标志物,包括有机酸、类脂、脂肪酸、氨基酸与胺类等；这些标志物在不同时间模型组的变化,表明大鼠胃溃疡发生与自愈过程的能量代谢、物质代谢与神经调节处于紊乱状态。4、运用基于GC-MS的代谢组学技术,获得了表征雷尼替丁及维胃方高、中、低剂量治疗组生物学特征的胃黏膜及尿液生物标志物。不同药物对胃黏膜及尿液的胃溃疡标志物水平呈现不同程度的回调,尤以中剂量WWF的回调程度最大,表明中剂量WWF治疗乙酸性胃溃疡疗效最佳；WWF通过整体调节机体的物质代谢、能量代谢与神经系统,有效治疗胃溃疡。5、运用代谢组学技术,从整体上阐释了大鼠乙酸性胃溃疡发生与自愈过程病灶与全身代谢的生物学特征及其机制；从系统的层面揭示了维胃方对胃溃疡病灶及全身调节的疗效机制,凸显了中药复方多靶点综合治疗的特色。代谢组学具有全局性与动态性的特点,符合中医的整体观,在中医药领域具有广泛应用前景。