目的建立和优化检测布鲁氏菌的实时荧光定量PCR方法,评价其在布鲁氏菌病诊断、疗效动态监测、治疗后随访监测复发中的作用,为布鲁氏菌病的早期诊断和指导抗菌治疗提供可靠的依据,以控制疾病的传播,降低致残率和复发率。资料与方法1.研究方法:（1）通过布鲁氏菌阳性患者的血培养标本制备标准品,而后对标准品进行普通PCR、多重PCR扩增,并采用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定;（2）所有人留取外周EDTA抗凝全血标本,24小时内提取DNA,-40℃储存;（3）所有DNA标本应用One step instrument的SYBR Green模式进行实时荧光定量PCR检测;（4）根据标准曲线和Ct值计算各标本布鲁氏菌DNA载量（Bru-DNA）及其对数值（log10（Bru-DNA））。2.研究对象及分组:均为2018年1月1日至2020年1月15日之间吉林大学第一医院患者和健康人群,布鲁氏菌病组126例,对照组94例（其中其它感染性疾病46例,健康人群48例）。对布鲁氏菌病组126例患者在治疗3周,治疗结束1、3、6个月进行随访,52例完成随访。按治疗3周的治疗效果分为有效组47例,无效组5例;按治疗后随访期是否复发分为未复发组44例,复发组8例。3.统计学分析及绘图方法:统计学分析采用SPSS26.0和R Studio3.5.3软件。计量资料首先进行正态分布和方差齐性检验,符合正态分布的数据以均数±标准差表示,不同组间比较采用独立样本t检验,同组不同时间的比较采取配对样本t检验;非正态分布数据以中位数和四分位数M(P₂₅,P₇₅)表示,不同组间比较采用Mann-Whitney U检验,同组不同时间的比较采取配对Wilcoxon检验;如任意一组样本量极少（n≤5）的比较,采用置换检验。分类资料以例数或百分数表示,采用Р²检验,P<0.05认为有统计学意义。扩增曲线、标准曲线及溶解曲线来源于qPCR设备软件,ROC曲线绘图采用SPSS26.0,研究分组和设计方案图采用viso2019,其余绘图采用R Studio3.5.3。结果1.布鲁氏菌qPCR检测方法的建立:获得的标准品经PCR、多重PCR扩增,并采用1%琼脂糖电泳进行鉴定,PCR产物于904bp可见荧光条带,多重PCR产物于208bp,733bp可见荧光条带,符合布鲁氏菌羊种。多次qPCR实验标准曲线R²为0.992（0.984,0.998）,均大于0.980;扩增效率93.0%（87.2%,99.0%）;溶解曲线提示溶解峰值约为75.5℃,主峰单一。2.布鲁氏菌qPCR法的检测结果及其在布鲁氏菌病诊断中的应用:布鲁氏菌病组log10（Bru-DNA）为4.26（3.83,4.91）,对照组log10（Bru-DNA）为2.64（2.34,3.03）,两者间有统计学差异（z=-12.382,P<0.001）;对照组其它感染性疾病亚组log10（Bru-DNA）为2.66（2.57,3.10）,健康人群亚组log10（Bru-DNA）为2.64（2.24,3.03）,两者间无统计学差异（z=-0.537,P=0.575）。ROC曲线下面积为0.988（95%CI:0.978-0.999）,Bru-DNA最佳cutoff值为2.94E+03copies/ml,灵敏度和特异度为96.8%,95.7%。3.布鲁氏菌qPCR法在布鲁氏菌病治疗监测中的应用:分别比较有效组和无效组治疗前和治疗3周的log10（Bru-DNA）,结果提示有效组47例治疗前为4.26（3.94,4.90）、治疗3周为3.53（2.85,3.93）,存在统计学差异（z=-5.736,P<0.001）。无效组5名患者治疗前数值分别为3.6284、4.3766、4.9736、5.1038、7.6274,治疗3周的数值分别为3.9435、4.6893、5.3444、4.3404、4.6776,两者之间无统计学差异（z=1.214,P=0.156）。4.布鲁氏菌qPCR法在布鲁氏菌病治疗后随访和监测复发中的应用:比较复发组和未复发组各时间段log10（Bru-DNA）,治疗前未复发组为4.25（3.90,4.89）,复发组为4.74（4.07,5.82）,两者无统计学差异（z=-1.268,P=0.214）。治疗3周未复发组为3.53（2.86,3.95）,复发组为4.18（3.45,4.68）,两者无统计学差异（z=-1.801,P=0.073）。治疗后随访期未复发组为2.89（2.65,3.15）,复发组为5.66（3.93,6.09）,两者有统计学差异（z=-3.779,P<0.001）。52名随访患者治疗前、治疗3周、治疗后随访的log10（Bru-DNA）对布鲁氏菌病复发风险结果提示,治疗前、治疗3周无统计学意义,治疗后随访有统计学意义,其OR及95%CI分别为23.557（1.820,304.874）。治疗后随访的log10（Bru-DNA）,治疗后随访较治疗前log10（Bru-DNA）变化量,治疗后随访较治疗3周log10（Bru-DNA）变化量预测布鲁氏菌复发的ROC曲线提示,治疗后随访AUC最高,Bru-DNA的最佳的cutoff值为5.58E+03copies/ml,灵敏度为87.5%,特异度为95.5%。结论1我们所建立的布鲁氏菌qPCR方法稳定性良好,产物单一,可重复性好,符合实验设计所需。2用qPCR方法检测布鲁氏菌DNA载量来区别布鲁氏菌病与非布鲁氏菌病者的最佳cutoff值为2.94E+03copies/ml,灵敏度为96.8%,特异度为95.7%,ROC曲线下面积为0.988（95%CI:0.978-0.999）。3应用布鲁氏菌qPCR法监测患者治疗前、治疗3周的Bru-DNA,并通过其变化情况,可以较好的对治疗效果进行判定。4对52名布鲁氏菌病患者进行qPCR监测结果提示,布鲁氏菌复发与治疗后随访期外周血布鲁氏菌DNA载量相关,预测布鲁氏菌病患者复发的Bru-DNA最佳cutoff值为5.58E+03copies/ml,灵敏度为87.5%,特异度为95.5%。治疗后随访布鲁氏菌DNA对数值对疾病复发的OR值为23.557,表明通过qPCR法监测布鲁氏菌病患者治疗后随访期的DNA载量,可以较好的对布鲁氏菌病复发进行预测。