论文部分内容阅读
植物ABC转运蛋白参与很多次级代谢产物的积累、排泌和转运,并在外源毒素的解毒和抗性应答中均发挥重要的作用,但是目前对植物ABC转运蛋白的研究几乎集中于模式植物,了解柚ABC转运蛋白对揭示蜜柚次级代谢产物的分子调控机制、植物防御反应机制和蜜柚品种改良均具有重要的意义。本研究基于红肉蜜柚转录组数据库,利用生物信息学分析方法发掘蜜柚中的ABC基因,并对其进行分类,利用实时荧光定量PCR技术对其进行基因特征分析、组织特异性分析、品种特异性分析和耐草甘膦胁迫响应初步分析,并对部分基因进行亚细胞定位分析,结果如下:1、基于红肉蜜柚转录组数据库,筛选得到50个柚ABC基因,对它们进行亚族分类,结果得到2个ABCA基因、10个ABCB基因、9个ABCC基因、2个ABCD基因、22个ABCG基因、1个ABCE基因、3个ABCF基因、1个ABCI基因。本试验主要对目前在植物界研究较多的ABCB、ABCC和ABCG亚族基因进行研究,即41个柚ABC基因,下载拟南芥各亚族基因,与柚ABC基因构建系统发育进化树,并结合BLAST结果对其进行命名。2、对所得到的柚41个ABC基因编码的蛋白质进行生物信息学分析预测,结果显示:CmABCs蛋白编码区长度为1821～5573bp,编码606～1923个氨基酸,分子量为64.32513～213.34760kDa,理论等电点为5.72～9.40;有13个不稳定蛋白,28个稳定蛋白;有4个亲水性蛋白,37个疏水性蛋白;除CmABCG24为分泌蛋白外,其余40个CmABCs蛋白为非分泌蛋白;CmABCs蛋白具有4～17个跨膜结构;CmABCB18定位于细胞膜和细胞质、CmABCG29定位于细胞膜和叶绿体、CmABCC2和CmABCC12定位于液泡,其余37个CmABCs蛋白均只定位于细胞膜;41个CmABCs均有不同的激酶潜在的磷酸化位点。3、通过荧光定量PCR技术,对41个CmABCs基因在白肉、红绵、红肉和三红蜜柚成熟前后汁胞内相对表达量变化进行分析,筛选出在四个品种成熟汁胞中比未成熟汁胞中表达量皆显著上升的基因共 5 个:CmABCB18、CmABCC10、CmABCG2、CmABCG14-2、CmABCG31,推测其可能参与次级代谢产物累积、排泌和转运。以红肉蜜柚花后143～213 d的近中柱汁胞和远中柱汁胞为材料,通过荧光定量PCR技术对这5个基因的变化特征进行分析,发现:CmABCC10和CmABCG31相对表达量无明显变化特征;CmABCB18在143～173 d的远中柱汁胞中表达量明显高于近中柱,其余时期无差异;CmABCG2、CmABCG14-2在近中柱和远中柱汁胞中相对表达量均呈总体上升趋势,但CmABCG2在发育后期的近中柱汁胞中表达量明显高于远中柱,CmABCG14-2在近中柱和远中柱汁胞之间无差异。对CmABCB18、CmABCG2、CmABCG14-2进行亚细胞定位分析,发现均定位于细胞膜,推测CmABCB18可能参与番茄红素转运,CmABCG2参与木质素合成,CmABCG14-2参与蜜柚果实生长发育过程。4、以白肉、红绵、红肉和三红蜜柚果实的海绵层、囊衣、汁囊柄和汁胞为样本,分别对CmABCB18、CnABCG2、CmABCG14-2进行组织特异性和品种特异性分析。CmABCB18在花后95-165 d的红绵、红肉和三红蜜柚中的囊衣、汁囊柄和汁胞中表达量均高于白肉;CmABCG2在花后95-135 d的四个品种的四个部位表达量较低且基本不变,165 d开始在不同品种和不同部位中出现差异;CmABCG14-2在四个品种的海绵层中表达量均明显高于其余部位。5、对柚22个ABCG基因进行分类,其中有13个属于PDR型。同源性分析结果表明:CmABCG39-2编码的氨基酸序列与拟南芥中转运百草枯除草剂的AtPDR11同源性最高,达69.25%,利用RT-PCR技术克隆得到CmPDR11-2的ORF序列。该序列长度为4371bp,编码一个含有1456个氨基酸的蛋白质,分子量165.13803kDa,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,无信号肽,具有12个跨膜结构,亚细胞定位预测结果显示位于细胞膜。实时荧光定量PCR结果表明,草甘膦除草剂胁迫处理条件下,1-15 d处理组的柚叶中CmPDR11-2表达量呈整体上升趋势,且均高于对照组,反应迅速且持久,这表明CmPDR11-2基因表达与红肉蜜柚耐草甘膦有关。