论文部分内容阅读
蛋白质谷氨酰胺酶（Protein-glutaminase,PG）可以特异性水解大分子蛋白质中谷氨酰胺残基,对天冬酰胺残基或游离谷氨酰胺等均无作用,在蛋白质改性中具有极其良好的应用前景。华东师范大学微生物实验室经长期筛选工作,获得了33株蛋白质谷氨酰胺酶产生菌株解朊金黄杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）,经鉴定是无致病性安全菌株,然而野生菌株蛋白质谷氨酰胺酶产量较低,需对菌株进行诱变选育。为进一步提高蛋白质谷氨酰胺酶产量,本研究选取实验室前期经原生质体融合选育得到的菌株PF-Y0360作为出发菌株,利用常压室温等离子体（Atmospheric Room Temperature Plasma,ARTP）诱变技术结合紫外辐射（ultraviolet,UV）复合诱变,进行递推式选育,并通过二代测序技术平台对高产菌株AU-J0789进行重测序和转录组测序,从组学角度探究高产分子机制。主要研究结果如下:1.常压室温等离子体诱变条件的优化以解朊金黄杆菌PF-Y0360为研究对象,对ARTP诱变的菌浓度、处理时间和气流量进行了单因素优化,以致死率和正突变率为判断依据,确定了诱变条件,结果显示,取对数生长期的细菌种子培养液,用生理盐水稀释至OD600=1.0,可获得较好的致死效果。当诱变时间设置为80 s,诱变气流量设置为10 splm时,致死率达到95%以上,正突变率达到16%。2.五轮递推式常压室温等离子体诱变选育高产菌株以PF-Y0360作为第一轮诱变选育出发菌株,从突变库中筛选得到PG活力增长最多的突变株作为第二轮诱变出发菌株,依次递推,五轮共诱变筛选了12720株突变菌,五轮高产菌株较该轮出发菌株酶活增加量分别为14.0%、17.3%、16.5%、10.4%、8.1%。3.两轮常压室温等离子体和紫外复合诱变选育高产菌株采用ARTP/UV复合诱变方法解决多轮诱变后带来的“疲劳效应”问题,两轮诱变共筛选了3348株突变株,酶活增长量分别为11.9%、14.0%。获得高产菌株AU-J0789,测定酶活2.04±0.02 U/m L,相对PF-Y0360酶活提高了137%。4.高产菌株性质研究种子生长曲线测定结果表明,菌株对数生长期为6-12 h,代谢产酶曲线测定结果表明,菌株生长6 h后开始产酶,酶活最高点位于14 h左右,并在12-15 h间基本稳定,长达48 h单位菌体量酶活保持较高水平。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析与酶活测定结果一致。连续传代50代,酶活均值为1.97±0.08 U/m L,变异系数为4.04%,有较好的遗传稳定性。菌株PG所在基因与出发菌相比没有变化,但荧光定量实验结果显示,高产菌株在发酵10、12、14 h时PG转录水平都显著高于出发菌株（p<0.05）。5.高产菌株高产分子机制初步探究以野生解朊金黄杆菌L11全基因组为参考基因组,完成高产菌株重测序和转录组测序。重测序得到52个SNP和6个Indel位点。SNP位点功能注释主要集中于代谢通路中的碳水化合物代谢、核苷酸代谢和氨基酸代谢,Indel位点功能注释全部属于蛋白质跨膜转运和修饰,多种因素共同促进了高产菌株PG酶活的提高。取发酵6、8、12 h三个时间点进行转录组测序,差异基因的GO注释分析表明高产菌株大量在生物进程方面的基因呈现上调,KEGG通路分析表明高产菌株中组氨酸代谢水平显著下调。推测磷酸戊糖途径中5-磷酸核酮糖向组氨酸合成途径的转化减少,更多地转化为中间产物果糖或3-磷酸甘油醛,回到糖酵解途径,加强了高产菌株的生长。