生命体是由各种生物大分子和小分子物质在分子、细胞器、细胞和组织等不同层面上协同工作，从而维持生命的延续。目前生命科学研究进入到了系统生物学阶段，要想在不同的尺度下更好地整体研究生命现象，有许多关键问题需要解决，包括:1、如何在细胞甚至组织层面上对样品进行大尺度三维重构;2、如何保持样品接近生理状态下的高分辨率原位结构;3、如何在细胞复杂内环境中识别特定细胞器和大分子物质等。　　本研究通过发展聚焦离子束扫描电镜(Focused Ion Beam scanning electronmicroscope，FIB/SEM)三维重构技术和冷冻FIB细胞原位切片技术，对在细胞层面研究囊泡的成熟过程和细胞器原位三维结构作出了探索。同时发展了冷冻超分辨光电融合技术，实现了在同一样品上电镜三维结构信息和蛋白质荧光定位信息的高精度整合。　　本文将FIB/SEM三维重构应用于具有重要临床意义的胰岛β细胞样品，获得了小鼠胰岛β细胞大尺度的三维重构（14×14μm2，厚度3-9μm）。胰岛素囊泡最开始在高尔基区域形成，然后运输到细胞膜进行释放，这中间囊泡会经历一个成熟过程，目前这一过程还很大程度上处于未知状态。通过FIB/SEM三维重构，能让我们定量分析囊泡从形成到分泌过程中的形态变化。分析表明，胰岛素囊泡在成熟过程中会发生囊泡的同型融合，同时变大且核心变得更加致密。通过自动化程序识别囊泡的致密核心，研究了二型糖尿病模型db/db小鼠胰岛素囊泡形态和分布特点，发现db/db小鼠中囊泡偏小偏浅，且主要分布在近膜区，证实其囊泡合成与运输过程均存在严重缺陷。用同样的方法，对hid-1基因敲除小鼠产生糖尿病表型的原因进行了探究。电镜三维形态学分析发现，hid-1 koβ细胞中细胞膜附近未成熟胰岛素囊泡比例明显增加，与高尔基区域新形成的囊泡的形态一致，说明囊泡的成熟过程出现了问题。通过体外融合实验和电镜三维图像统计进一步发现，未成熟胰岛素囊泡增加可能是由于囊泡同型融合受阻，说明HID-1在囊泡成熟过程中扮演着重要角色，为阐明囊泡的成熟过程提供了线索。　　常温电镜虽然能在较大尺度上研究细胞内结构，但是由于固定和染色过程，丢失了许多高分辨率信息。为了研究细胞器原位的三维结构，本文发展了近年来兴起的冷冻FIB切片技术(cryo-FIB mining)，摸索了两种不同的切片方式:平行切片和楔形切片，可以分别保存细胞内部或者近细胞膜区的原位结构。通过冷冻电镜观察到了一系列细胞器的三维原位结构，包括:自噬体，多层膜囊泡，细胞骨架，线粒体，内质网涡旋等。为了弥补冷冻FIB/SEM不能区分细胞状态和样品厚度的缺点，本文摸索了通过FEI公司的光电一体化装置iCorr的光电联合成像来对冷冻FIB切片位置进行指导。并且通过iCorr和自主研发的光学冷台第一次实现了在切片后对冷冻FIB切片进行光学和电镜的同时观察，为真正在原位解析生物大分子复合物的结构奠定了基础。　　为在复杂的细胞内环境中识别特定细胞器和大分子物质，本文探索了冷冻超分辨光电融合技术。通过高压冷冻和冷冻含水切片制备哺乳动物细胞冷冻切片样品（TOM20-Dronpa，HEK293），在自主研发的冷冻光学平台上成功实现了液氮温度下的超分辨荧光成像，定位精度小于10 nm。随后通过加入金颗粒和荧光珠进行图像配准，实现了冷冻光镜和电镜的图像融合，配准误差小于20 nm。我们的光电融合成像结果清楚地展示了TOM20蛋白在线粒体外膜附近的分布，以及DHS-3在脂滴膜上的分布情况。