实验目的:G蛋白偶联受体激酶6(G protein-coupled kinase 6,GRK6)是一种重要的蛋白质,它通过磷酸化G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)胞质区域的特定氨基酸残基来调节细胞信号。研究表明,GRK6在炎性痛和神经病理性疼痛的产生与维持中发挥着重要作用。但是,有关GRK6在慢性内脏痛敏中的作用与机制尚不完全清楚。下丘脑弓状核(Arcuate nucleus,ARC)是中枢参与痛觉调制的重要核团。本研究旨在探讨大鼠下丘脑弓状核内GRK6与核转录因子kappa-B(Nuclearfactor-κB,NF-κB)信号通路在慢性内脏痛敏中的作用及其机制。实验方法:1.模型制作:采用新生期母爱剥夺(Neonatal maternal deprivation,NMD)建立慢性内脏痛大鼠模型。2.痛行为学检测:采用结直肠扩张(Colorectal distention,CRD)和腹壁撤回评分(Abdominal withdrawal reflex scores,AWR scores)法检测成年大鼠的慢性内脏痛反应;采用VFF(von Frey filament,VFF,0.4-15g)方法检测大鼠后足退缩阈值(Paw withdrawal threshold,PWT);利用热刺痛仪检测辐射热使大鼠后足退缩的潜伏期(Paw withdrawal latency,PWL)。3.分子表达检测:采用蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色、实时定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)以及尼氏染色方法检测成年大鼠ARC内GRK6与NF-κB分子的表达、分布及其相互作用关系。4.药理学方法:ARC内微量注射NF-κB选择性拮抗剂PDTC(Pyrrolidine dithiocarbamate),观察大鼠痛行为以及ARC内GRK6分子的蛋白表达。5.遗传学方法:采用ARC内微量注射LV-GRK6(Lentiviral vectors GRK6,GRK6 慢病毒)或 LV-NC(Lentiviral vectors negative control,慢病毒阴性对照溶液),观察大鼠痛行为以及ARC内GRK6、NF-κB分子的蛋白表达。实验结果:1.与对照组大鼠相比,NMD组大鼠CRD阈值显著降低(***p<0.001),AWR评分值显著升高(*p<0.05,**p<0.01)。然而,NMD组大鼠后足机械痛阈值和热痛阈值均无显著变化(p>0.05)。结果表明,NMD诱发成年大鼠产生慢性内脏痛敏反应,但不影响大鼠体表的机械痛和热痛反应。2.蛋白质免疫印迹检测结果显示,NMD显著下调大鼠ARC内GRK6蛋白表达(*p<0.05),但不影响基底外侧杏仁核(Basolateral amygdala,BLA)和岛叶皮层(Insular cortex,IC)内GRK6蛋白表达(p>0.05)。免疫荧光结果表明,GRK6主要表达于ARC神经元,小胶质细胞中有少量表达,星形胶质细胞中未见表达;同时,NMD显著降低成年大鼠ARC内GRK6阳性神经元的百分比(*pp<0.05)。3.NMD显著上调大鼠ARC内NF-κB蛋白表达(**p<0.01),但不影响基底外侧杏仁核和岛叶皮层内NF-κB蛋白表达(p>0.05)。免疫荧光结果表明,GRK6与NF-κB共标于大鼠ARC神经元。4.ARC内单次微量注射PDTC可翻转NMD大鼠慢性内脏痛敏反应(*p<0.05,***p<0.001),其有效作用时间持续30 min;连续7天ARC内微量注射PDTC同样能翻转NMD大鼠慢性内脏痛敏反应(***p<0.001),且有效作用时间持续120 min。5.ARC内过表达GRK6能够翻转NMD大鼠内脏痛(**p<0.01,***p<0.001),同时显著下调NMD大鼠ARC内NF-κB蛋白表达(*pp<0.05),但不影响大鼠后足的机械痛和热痛阈值(p>0.05);ARC内连续7天微量注射PDTC(800ng/kg)不影响NMD大鼠ARC内GRK6蛋白表达(p>0.05)。实验结论:新生期母爱剥夺导致成年大鼠ARC内GRK6表达下调,从而引起ARC内NF-κB表达上调,进而介导NMD大鼠产生慢性内脏痛敏反应。结果提示,GRK6可能是ARC参与NMD大鼠内脏痛敏的关键分子,为治疗慢性内脏痛寻找新靶点提供了实验依据。