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乳腺癌是许多国家常见的女性恶性肿瘤,高发病率和高死亡率使其成为严重的公共卫生问题,日益威胁女性的健康。乳腺癌病因复杂,通常认为是由环境因素、生殖因素以及遗传因素共同作用的结果。大量研究发现长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)能够影响肿瘤的发展,并且涌现了众多的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)与肿瘤易感性之间存在关联的报道。有研究表明MIR2052HG可影响乳腺癌患者耐药性,即LncRNA MIR2052HG在药物基因组学具有重要作用。但截止目前,尚未有研究报道MIR2052HG的遗传变异SNPs与乳腺癌易感性之间存在关联。目的本研究通过生物信息学以及分子流行学筛选乳腺癌相关的LncRNA MIR2052HGSNPs。对MR2052HG功能性SNPs进行生物学功能预测,通过细胞学实验进行验证,从而明确LncRNAMIR2052HG SNPs调控乳腺癌的分子生物学机制。方法(1)生物信息学筛选MIR2052HGSNPs并预测其功能:使用NCBI、Ensembl网站明确MIR2052HG的位置及序列信息,1000 Genomes网站、Haploview软件筛选中国人群MAF值大于0.05的MIR2052HG SNPs,RNAfold网站预测MIR2052HG SNPs 的二级结构,lncRNASNP2、DIANA 等网站预测MIR2052HG SNPs 的靶向 miRNAs。(2)乳腺癌易感性相关的MIR2052HG SNPs探索:采用病例对照研究,共纳入504例病例和505对照(以年龄进行频数匹配)。提取研究对象的外周血DNA,并使用 SNPscan 的方法及 GeneMapper 软件对MIR2052HG SNPs(rs3802201、rs2553716、rs4259395、rs2588297、rs10957736、rs269183、rs269198、rs34841297、rs12546233)进行基因分型。(3)MIR2052HG表达量的检测:实时荧光定量PCR采用相对定量法,经SYBR染色检测对照人群血浆中rs34841297不同基因型的MIR2052HG的相对表达量。(4)MIR2052HG SNP与miRNA结合的实验验证:构建MIR2052HG rs34841297野生型和MIR2052HG rs34841297突变型的质粒,并与miR-4456 mimics以及normal control mimics进行细胞共转染,进行双荧光素酶实验明确rs34841297的基因多态性是否影响MIR2052HG与miR-4456的结合。(5)miRNA的生物学功能研究:构建miR-4456低表达、miR-4456高表达以及normal control的慢病毒载体,并转染乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和MCF-7)进行稳定转染细胞株的筛选。经荧光定量PCR实验检测筛选后的稳定转染细胞株的miR-4456表达量。然后使用稳定转染的细胞株进行CCK8实验、Transwell实验以及划痕实验检测miR-4456表达量不同的乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。(6)统计学分析:进行了校正年龄、初潮年龄、绝经状态、怀孕次数、流产次数、哺乳史和家族史七个因素的非条件Logistic回归分析,探索乳腺癌相关的MIR2052HG SNPs;运用SHEsis在线软件进行MIR2052HG SNPs的单倍体分析;采用多因子降维法(MDR)分析基因与环境之间的交互作用;使用独立样本t检验比较不同rs34841297基因型的LncRNAMIR2052HG的相对表达量;通过t检验分别比较CCK8实验中miR-4456低表达组、miR-4456高表达组与normal control组之间OD值的差异,明确miR-4456是否对细胞增殖产生影响;Transwell实验对染色细胞进行精确计数,然后通过独立样本t检验对比miR-4456低表达组、miR-4456高表达组与normal control组之间侵袭和转移的细胞数目是否存在差异以判断miR-4456是否会影响细胞的侵袭和迁移;划痕实验计算划痕愈合率,通过独立样本t检验对比miR-4456低表达组、miR-4456高表达组与normal control组之间的划痕愈合率,进一步明确miR-4456是否会影响细胞的迁移。结果(1)rs3802201 CG+GG型个体患乳腺癌的风险低于CC型(OR:0.756,95%CI:0.580-0.986),rs2553716(A>C)是乳腺癌的保护因素(OR:0.737,95%CI:0.565-0.931);与rs4259395AA基因型相比,AG+GG的患病风险降低(OR:0.756,95%CI:0.573-0.999);rs2588297的基因变异(G>T)可降低乳腺癌的易感性(OR:0.606,95%CI:0.459-0.798);rs10957736(C>T)和 rs12546233(A>C)的突变之后均发挥保护作用。而rs269183(T>C)与Her-2受体状态(OR:1.755,95%CI:1.030-2.991)以及 Her-2 过表达型乳腺癌(OR:0.677,95%CI:0.319-1.437)存在关联。rs269198(C>A)与Her-2过表达型乳腺癌有关联(OR:0.677,95%CI:0.319-1.437)。rs4259395 的 GG 基因型与 PR 受体状态有关联(OR:1.905,95%CI:1.012-3.585),rs2588297 的 TT 基因型与 luminal 型有关联(OR:3.716,95%CI:0.987-13.996)。rs3802201(C>G),rs2553716(A>C)均表现为与 PR 受体和luminal型乳腺癌有关,且具有统计学意义。此外,rs12546233的AC+CC基因型与三阴型有关联(OR:0.497,95%CI:0.260-0.949);同时,AA基因型与Her-2过表达型有关联(OR:1.738,95%CI:1.033-2.921)。(2)单体型Crs3802201Ars2553716Ars4259395Grs2588297Crs10957736Trs269183Crs269198 Wrs34841297Ars12546233 可增加乳腺癌患病风险(OR:1.203,95%CI:1.001-1.445)。单体型Grs3802201Crs2553716Grs4259395Trs2588297Trs10957736Trs269183Crs269198Mrs34841297 Ars12546233以及单体型Grs3802201Crs2553716Grs4259395Trs2588297Trs10957736Trs269183 Crs269198Mrs34841297 Crs12546233可降低乳腺癌的患病风险(分别为OR:0.258,95%CI:0.073-0.908;OR:0.698,95%CI:0.549-0.887)。且基因与环境的交互作用分析显示,MIR2052HG rs2588297与怀孕次数、流产次数之间存在明显交互作用,并且会增加乳腺癌的发病风险(OR:2.934,95%CI:2.272-3.790)。(3)MIR2052HG在rs34841297 A基因纯合缺失(1.68±1.37)和杂合缺失(0.95±0.94)的个体中的相对表达量高于AA基因型的个体(0.26±0.12)(分别为:P<0.001,P=0.001)。(4)在293T细胞中进行双荧光素酶报告实验,结果提示MIR2052HG与miR-4456的结合由rs34841297介导,当rs34841297出现缺失突变时,结合不存在。(5)在乳腺癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)中分别进行CCK8试验,结果表示miR-4456与乳腺癌的增殖有关。与normal control组相比,高表达miR-4456的乳腺癌细胞增殖能力强(P<0.05),低表达miR-4456乳腺癌细胞增殖能力相对较弱(P<0.05)。(6)Transwell实验显示miR-4456低表达组的MDA-MB-231细胞侵袭数目低于normal control组(P<0.001),miR-4456高表达组的MDA-MB-23 1细胞侵袭数目高于 normal control 组(P=0.002)。(7)Transwell迁移实验与划痕实验的结果显示miR-4456低表达组的MDA-MB-231 细胞迁移数目低于 normal control 组(P=0.004,P=0.024),miR-4456 高表达组的 MDA-MB-23 1 细胞迁移数目高于 normal control 组(P=0.022,P=0.001)。结论(1)MIR2052HG rs3802201(C>G)、rs2553716(A>C)、rs2588297(G>T)、rs10957736(C>T)和rs12546233(A>C)的基因多态性可降低乳腺癌的患病风险,而rs34841297缺失突变会增加患乳腺癌的风险。rs3802201、rs2553716和rs4259395 与 PR 受体有关联,rs269183 与 Her-2 受体有关联。rs3802201、rs2553716以及rs2588297与luminal型有关联。rs269183、rs269198与Her-2过表达型有关联。rs12546233的AC+CC基因型与三阴型有关联;同时rs12546233的AA基因型与Her-2过表达型有关联。(2)单 体 型 Crs3802201Ars2553716Ars4259395Grs2588297Crs10957736Trs269183Crs269198 Wrs34841297Ars12546233可增加乳腺癌患病风险单体型 Grs3802201Crs2553716Grs4259395 Trs2588297Trs10957736Trs269183Crs269198Mrs34841297Ars12546233以及单体型 Grs3802201Crs2553716 Grs4259395Trs2588297Trs10957736Trs269183Crs269198Mrs34841297Crs12546233 可降低乳腺癌的患病风险。MIR2052HGSNPs与生殖因素之间存在交互作用。(3)rs34841297的A位点缺失与MIR2052HG的表达量增加有关。(4)MIR2052HG与miR-4456之间存在rs34841297介导的结合作用,并且MIR2052HG可通过miR-4456影响乳腺癌细胞的增殖、侵袭以及迁移。