研究背景和意义结直肠癌是消化系统中较常见的恶性肿瘤,发病率占消化道肿瘤第三位,并且随居民膳食结构发生变化,其患病率有逐年上升的趋势。近年以来多数患者能够发现早期肿瘤,并且进行相应的治疗。然而,即使在疾病早期能够切除原发肿瘤,大约40%的患者5年内仍会出现腹腔内复发与/或肝转移。结直肠癌伴有肝脏转移的患者行同期肝切除手术后5年生存率只有10.8%,对人民群众身体健康危害极大。目前,手术切除依旧是结直肠癌治疗中最为有效的手段,但是由于结直肠癌患者症状不典型以及发病较隐匿,致使很多患者错失手术治疗的机会,考虑到减少化疗所致严重毒副反应,中医中药及放射治疗逐渐成为治疗中晚期结直肠癌的研究热点。目前中西医结合治疗结直肠癌等恶性肿瘤是肿瘤综合性治疗的重要措施,已经越来越受到重视。表毛萼甲素(Epieriocalyxin A, EpiA)和毛萼乙素(Eriocalyxin B, EriB)是两种从采自云南省江川县的疏花毛萼香茶菜(Isodon eriocalyx)植物中提取的贝壳杉烷二萜类化合物。长期以来毛萼乙素在临床抗癌领域被广为研究,然而关于表毛萼甲素的抗癌研究却少之又少,作为二萜类化合物表毛萼甲素是否也能抗癌?如何发挥抗癌作用尚无决定性结论。目前,以信号转导通路分子为治疗靶点的抗肿瘤中成药物因其毒性小、疗效好及无耐药等优点已成为研究热点。我们前期预实验发现EpiA可诱导人结肠癌Caco-2细胞凋亡,作为胞外刺激因子EpiA究竟通过哪些信号转导通路启动结肠癌肿瘤细胞的凋亡途径,其具体针对的靶点又是哪种或哪几种,目前仍未明确。可见深入研究EpiA能施加影响的肿瘤细胞中的具体信号转导通路,有助于明确EpiA在细胞内作用的靶点及其抗肿瘤分子机制。另外,国外大量荟萃分析显示术前单独辅助放射治疗对降低直肠癌局部复发率有明显效果,但是相当数量患者对放疗不敏感且放疗后组织易粘连或限制了术前放疗的发展,结直肠癌恶性生物学本质固有与医源性获得导致放疗抵抗成为临床治疗中难以逾越障碍,因辐射引起的放疗抵抗导致只有小部分患者真正从中受益。临床综合治疗为提高放疗的敏感性常辅助化疗与靶向治疗,如何增敏辐射疗效并削减结直肠癌的放疗抵抗给临床与基础研究提出巨大挑战。辐射抵抗的发生是个复杂过程,涉及DNA修复蛋白的过度表达,多个信号通路的异常激活,血管再生,肿瘤干细胞以及细胞自噬。有研究发现亚致死剂量放疗辐射增强人类恶性胶质瘤细胞侵袭与迁移,该生物学行为经由非P53依赖途径,可上调整合素αvβ3表达,明显提高MMP-2与MMP-9表达量与活性,下调MT1-MMP与MMP-2抑制剂TIMP-1活性,最终上调BCL-2/BAX抑制细胞凋亡致放疗抵抗。整合素属于细胞表面黏附分子家族,通过影响细胞基因表达及细胞内外信号传导过程促进细胞增殖、分化、侵袭和转移。课题组前期研究表明：不同种类的结肠癌细胞整合素αvβ6表达量不同;αvβ6在结肠癌标本侵袭边缘高表达,而在肿瘤内部则为低表达,与肿瘤恶性进展密切相关。已知结直肠癌中αvβ6表达上调可以提高结肠癌细胞抵御凋亡并促进其侵袭与迁移,但αvβ6对结直肠癌放疗抵抗的影响,目前国内外尚未见报道。本课题拟在前期研究基础上,观察整合素αvβ6在结肠癌细胞放射治疗中的表达变化,深入探讨整合素αvβ6在结肠癌放射治疗过程中调控侵袭及凋亡抵抗等恶性生物学行为的具体分子机制,有助于深入理解放疗抵抗的发生及危害,深入认识整合素αvβ6在结肠癌恶性进展中的作用,为以αvβ6为靶点进行高效无毒的靶向治疗辅助结直肠癌放疗提供实验依据与理论基础,从而对提高结直肠放疗疗效及改善预后将起到重要的促进作用。第一部分表毛萼甲素通过ERK1/2及JNK信号通路诱导结肠癌细胞凋亡的实验研究目的研究表毛萼甲素诱导人结肠癌细胞Caco-2凋亡的分子机制。方法1.利用CCK-8细胞增殖实验检测表毛萼甲素对结肠癌细胞Caco-2生长的抑制效应；2.利用Annexin-V/PI双染流式细胞术观察表毛萼甲素对结肠癌细胞Caco-2细胞凋亡的诱导作用；3.利用Hoechst 33342荧光染色检测表毛萼甲素处理后结肠癌Caco-2细胞凋亡程度；4.利用流式细胞术检测表毛萼甲素对结肠癌Caco-2细胞线粒体膜电位变化的影响;5.ROS(活性氧)荧光探针流式细胞术检测表毛萼甲素对结肠癌Caco-2细胞内ROS激活的影响；6. Western blot分析表毛萼甲素对结肠癌Caco-2细胞内信号通路中蛋白激酶表达量及磷酸化程度(Akt,JNK,ERK1/2,P38及p-Akt,p-JNK,p-ERK1/2, P-P38)的影响;7. Western blot检测表毛萼甲素对结肠癌Caco-2细胞内凋亡相关caspase-3、 Bcl-2和Bax蛋白表达量变化的影响；8. Hoechst 33342荧光染色检测EpiA处理、ROS抑制以及JNK或ERK1/2磷酸化阻断对人结肠癌Caco-2细胞凋亡的影响；9. Western blot检测ROS抑制对EpiA下调JNK与ERK1/2信号通路的影响；10. Western blot检测EpiA处理、ROS抑制以及JNK或ERK1/2磷酸化阻断对人结肠癌Caco-2细胞内caspases及Bcl-2/Bax凋亡蛋白表达的影响；11. Western blot检测EpiA诱导人结肠癌Caco-2细胞凋亡过程中对pIicBa及cytochrome C的影响。结果1.CCK-8细胞增殖实验证实表毛萼甲素能明显抑制人结肠癌Caco-2细胞生长,且抑制效应与药物作用时间及药物浓度有关；2. Annexin-V/PI双染流式细胞术及Hoeehst33342荧光染色检测证实表毛萼甲素能够诱导Caco-2细胞凋亡,1μg/ml表毛萼甲素处理24小时,细胞凋亡率可达41.6%；3. Hoeehst33342荧光染色实验表明用SP600125及PD98059分别抑制JNK及ERK1/2信号通路能阻滞EpiA诱导的Caco-2细胞凋亡；4.流式细胞术检测结果证实表毛萼甲素引起结肠癌Caco-2细胞线粒体膜电位下降；5.ROS荧光探针及流式细胞术检测表明表毛萼甲素随浓度增加剂量依赖性的提高结肠癌Caco-2细胞内ROS的水平；6. Western blot检测分析证实,Caco-2细胞经表毛萼甲素处理后p-ERK(磷酸化-ERK)及p-JNK(磷酸化-JNK)含量随表毛萼甲素浓度增加而逐渐降低,细胞内Akt、P38、ER、JNK、p-Akt(磷酸化-Akt)和p-P38(磷酸化-P38)水平无明显变化；7. Western blot分析表明,Caco-2细胞经EpiA处理后caspase-3与Bax蛋白表达水平随表毛萼甲素浓度增加而逐渐增加,而Bcl-2蛋白表达水平随表毛萼甲素浓度增加而逐渐下降;8. Hoeehst33342荧光染色证实NAC组与1μg/mlEpiA+NAC组Caco-2细胞凋亡率未见显著改变,细胞凋亡率比1μg/ml EpiA处理组明显降低；SP600125(JNK抑制剂)能诱导Caco-2细胞凋亡,凋亡率较Oμg/ml EpiA处理组下降,较1 μg/ml EpiA处理组显著升高；PD98059 (ERK1/2抑制剂)能诱导Caco-2细胞凋亡,凋亡率较0μg/ml EpiA处理组下降,较1μg/ml EpiA处理组显著升高；9. Western blot结果表明1μg/ml EpiA联合NAC处理Caco-2细胞即(1+NAC)组磷酸化-JNK (p-JNK)与磷酸化-ERK1/2 (p-ERK1/2)蛋白表达水平较1μg/ml EpiA明显升高；与0μg/ml EpiA处理组无统计学差异；10. Western blot结果表明1μg/ml EpiA处理Caco-2细胞后caspase-3及Bax表达上调而Bcl-2表达下调,用SP600125(JNK抑制剂)及PD98059(ERK1/2抑制剂)阻断JNK及ERK1/2信号通路后诱导Caco-2细胞caspase-3, Bax表达上调水平比0μg/ml EpiA组高比1μg/ml EpiA组低,Bcl-2表达下调水平比0μg/ml EpiA组高比1μg/ml EpiA组低。联合NAC后1μg/ml EpiA处理组caspase-3及Bax、Bcl-2蛋白表达水平与0μg/ml EpiA组无变化,即1μg/ml EpiA诱导的caspase-3及Bax表达上调与Bcl-2表达下调受到显著抑制；11. Western blot结果表明EpiA处理后Caco-2细胞内pIκBα表达水平递减,有剂量相关性；cytochrome C表达有递增趋势,亦呈剂量相关性。1μg/ml EpiA处理细胞内pIκBα表达水平显著下降,再加入NAC预处理pIκBα表达水平显著上调,EpiA对pIκBα表达的抑制被显著逆转；合并加入20μmol/L PD98059(ERK1/2抑制剂)与40μmol/L SP600125(JNK抑制剂)后,细胞内pIκBα表达水平亦显著下降。结论及意义表毛萼甲素可剂量依赖性的提高Caco-2细胞内ROS的水平,可剂量相关的上调Caco-2细胞内ROS的水平并下调MAPK家族中ERK1/2与JNK的磷酸化,抑制ERK/MAPK及JNK/MAPK信号通路,进而抑制细胞内pIκBα表达水平,NF-κB的解离与核转录下调,其下游凋亡蛋白Bcl-2的表达亦受到抑制,Bcl-2及Bax的表达及构型变化促使线粒体PT孔开放,线粒体膜电位下降至崩溃后,细胞色素C释放,后激活caspase-3诱导Caco-2线粒体途径细胞凋亡。值得注意的是,表毛萼甲素对Caco-2细胞的促凋亡作用可被抗氧化剂NAC完全逆转。本实验揭示了表毛萼甲素抑制结肠癌肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡的具体机制,为未来该新型化合物参与结直肠癌的辅助治疗提供了确切的生物学依据与理论基础,为结直肠癌抗肿瘤的药物治疗提供了新的途径。caspase-3及Bax、Bcl-2蛋白表达水平与0μg/ml EpiA组无变化,即1μg/ml EpiA诱导的caspase-3及Bax表达上调与Bcl-2表达下调受到显著抑制；11. Western blot结果表明EpiA处理后Caco-2细胞内pIκBα表达水平递减,有剂量相关性；cytochrome C表达有递增趋势,亦呈剂量相关性。1μg/ml EpiA处理细胞内pIκBα表达水平显著下降,再加入NAC预处理pIκBα表达水平显著上调,EpiA对pIκBα表达的抑制被显著逆转；合并加入20μmol/L PD98059(ERK1/2抑制剂)与40μmol/L SP600125(JNK抑制剂)后,细胞内pIκBα表达水平亦显著下降。结论及意义表毛萼甲素可剂量依赖性的提高Caco-2细胞内ROS的水平,可剂量相关的上调Caco-2细胞内ROS的水平并下调MAPK家族中ERK1/2与JNK的磷酸化,抑制ERK/MAPK及JNK/MAPK信号通路,进而抑制细胞内pIκBα表达水平,NF-κB的解离与核转录下调,其下游凋亡蛋白Bcl-2的表达亦受到抑制,Bcl-2及Bax的表达及构型变化促使线粒体PT孔开放,线粒体膜电位下降至崩溃后,细胞色素C释放,后激活caspase-3诱导Caco-2线粒体途径细胞凋亡。值得注意的是,表毛萼甲素对Caco-2细胞的促凋亡作用可被抗氧化剂NAC完全逆转。本实验揭示了表毛萼甲素抑制结肠癌肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡的具体机制,为未来该新型化合物参与结直肠癌的辅助治疗提供了确切的生物学依据与理论基础,为结直肠癌抗肿瘤的药物治疗提供了新的途径。第二部分电离辐射上调β6激活ERK/MAPK通路诱导结直肠癌细胞高侵袭表型及放疗抵抗的实验研究目的探讨整合素β6在结直肠癌放射治疗中调控其恶性进展及放疗抵抗的具体分子机制。方法1.利用Transwell侵袭实验检测结肠癌细胞HT-29, WiDr与Caco-2经受放疗OGy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy电离辐射(IR)处理后IR组与未经电离辐射处理Non IR组体外侵袭能力；6Gy IR处理WiDr、HT-29及Caco-2细胞后,在不同时间点6h、h、16h、24h观察WiDr、HT-29及Caco-2细胞体外侵袭能力；2.利用逆转录PCR与Western blot实验检测结肠癌HT-29, WiDr与Caco-2细胞整合素亚基αv及β6的mRNA和蛋白表达情况；利用RT-PCR与Western blot实验检测结肠癌HT-29在电离辐射梯度OGy、2Gy、Gy、6Gy、8Gy照射下mRNA和蛋白表达情况；3.人工合成3条双链不同序列的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA),通过脂质体2000转染导入表达β6的结肠癌细胞HT-29及WiDr后24h后,用RT-PCR检测β6 mRNA水平,筛选出能有效抑制β6表达的siRNA序列。利用Transwell侵袭实验检测结肠癌HT-29各设定组(1) Control (2) AIIB2(抗αvβ1)(3)LM609(抗αvβ3)(4)F1P6(抗αvβ5)(5)IgG1(6)10D5(抗αvβ6)(7)IgG2a经IR6Gy处理前后的体外侵袭水平变化,标准单克隆抗体IgG2aIgG1作为阴性对照。利用Transwell侵袭实验检测结肠癌HT-29.(.1) Control (2) siβ6 (3) siNC (4) 10D5 (5) IgG2a (6) PD98059组IR6Gy处理前后的体外侵袭水平变化；4. Western blot实验检测梯度剂量电离辐射0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8 Gy对基质金属蛋白酶MMP-9与MMP-2的影响；Western blot实验检测电离辐射下结肠癌HT-29各设定组(1) Non IR (2) IR (3) IR+siβ6 (4) IR+siNC (5) IR+IgG2a (6) IR+10D5组中MMP2与MMP9的蛋白表达,IR剂量为6Gy电离辐射；5. Western blot实验检测不同IR剂量0Gy、2Gy及6Gy下人结肠癌HT-29细胞MAPK信号传导通路关键因子ERK、P-ERK、JNK、P-JNK、P38、P-38的蛋白表达活化情况；Western blot实验分别检测人结肠癌HT-29 (1) Non IR (2) IR (3) IR+sip6 (4) IR+10D5 (5) IR+siNC (6) IR+IgG2a组各自细胞MAPK信号传导通路表达情况,IR剂量为6Gy电离辐射；6.裸鼠分Non IR组、IR组、IR+10D5(avp6单克隆抗体(组、IR+IgG isotype组,皮下种植等量结肠癌HT-29细胞,待瘤体长到约0.8-1cm左右,瘤旁注射10D5(10mg/kg,一天一次)或IgG isotype,放射治疗组给予20Gy分割辐射剂量,观察其成瘤能力的变化,3周后取瘤体,用游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤最长径(a)和最短径(b)(精确0.1mm),计算并观察各组肿瘤体积变化(V=0.5ab2),TUNEL免疫组化染色检测细胞凋亡；7.Caco-2结肠癌细胞分为已稳定转染含β6基因质粒组(Caco-2 β6-transfectant)、转染含β6突变基因质粒组(转染表达的β6蛋白缺失与ERK2的结合位点)(Caco-2 p6 Mutant-transfectant)和转染空白质粒组(Caco-2 Mock-transfectant);6Gy电离辐射作用于Caco-2各组细胞,Western bloting实验检测MMP9蛋白表达及凋亡相关分子Bcl-2和Bax表达情况。结果1.电离辐射(IR)可促进WiDr、HT-29细胞在Transwell小室上的侵袭能力,在IR 6Gy剂量处理下为WiDr、HT-29细胞体外侵袭能力峰值,对结肠癌细胞Caco-2体外侵袭能力无明显影响；电离辐射(IR)6Gy剂量处理WiDr、HT-29及Caco-2细胞后,在不同时间点6h、8h、16h、24h观察到WiDr, HT-29体外侵袭能力均有显著提升,而Caco-2细胞体外侵袭能力未见显著性改变；2.逆转录PCR与Western blot实验结果表明：结肠癌细胞HT-29,WiDr表达整合素β6,而结肠癌细胞Caco-2不表达整合素β6,三组细胞整合素αv的表达无明显差异。IR梯度照射能显著上调结肠癌细胞HT-29中整合素β6mRNA及蛋白的表达,6Gy剂量可达峰值。IR对结肠癌细胞HT-29整合素αv表达无影响；3. Transwell侵袭实验结果表明,αvβ6功能阻断抗体10D5可显著抑制HT-29细胞体外侵袭能力(P<0.05);IR与10D5合用后,此种抑制作用显著增强(P<0.01),而整合素αvβ1、αvβ3与αvβ5的单克隆抗体AIIB2、LM609和F1P6则对HT-29细胞的体外侵袭能力无显著的抑制效应(P>0.05);siRNA介导抑制β6表达显著下调电离辐射后结肠癌细胞HT-29的体外侵袭能力,信号通路特异性ERK1/2抑制剂PD98059能明显抑制IR诱发的结肠癌细胞HT-29体外侵袭(P<0.05);4. Western blot实验表明梯度剂量IR能显著上调HT-29中MMP-9的表达(P<0.05 vs Non IR组),不同剂量电离辐射0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8 Gy对基质金属蛋白酶MMP-9蛋白的表达影响不同；梯度剂量IR对基质金属蛋白酶MMP-2表达没有显著影响(P>0.05)。整合素β6特异性siRNA沉默基因表达或αvβ6特异性功能抑制剂10D5预处理HT-29细胞后,能明显抑制IR对MMP-9蛋白表达的上调作用(P<0.05 vs Non IR组)；对MMP-2蛋白表达没有显著影响(P>0.05)；5. Western blot实验结果表明,IR能诱导HT-29细胞中p-ERKl/2高表达(P<0.05vs Non IR组),但不影响t-ERK1/2、p-JNK、p-p38、t-JNK和t-p38的表达(P>0.05)。siRNA介导p6基因沉默或10D5抗体封闭αvβ6功能后,都可显著抑制IR诱导的p-ERK高表达(P<0.05 vs Non IR组),对t-ERK1/2、p-JNK、p-p38、t-JNK和t-p38的表达没有影响(P>0.05)；6.种植后3周,Non IR组细胞形成肿瘤平均体积约为(361±17.23) mm3, IR组(284±14.97) mm3、IR+10D5组(61±7.79) mm3、IR+IgG isotype组约为(265±13.74)mm3, IR+10D5组瘤体体积显著比Non IR组及IR组小,差异有显著性(P<0.05)。TUNEL免疫组化细胞凋亡结果显示,IR+10D5组细胞凋亡率显著高于Non IR组与IR组,提示阻断整合素β6表达能显著提升放射治疗效果,αvβ6单克隆抗体10D5能显著增敏结肠癌放疗；7.将整合素β6转染表达于结肠癌Caco-2细胞后,Western blot检测实验结果显示,当整合素β6缺失与ERK2的直接连接后,IR作用前后β6介导的Bcl-2表达上调而Bax表达下调现象受到显著抑制,能有效抑制整合素β6介导的结肠癌细胞的放疗抵抗；IR作用前后整合素β6导致的MMP-9表达上调现象受到显著抑制,能有效抑制整合素β6介导的结肠癌细胞对电离辐射的反应性高侵袭表型。提示p6在放射治疗后介导胞外基质降解与放疗抵抗并经由αvβ6-ERK2直接通路实现。结论及意义放疗电离辐射可上调整合素αvβ6阳性细胞的αvβ6表达,通过激活ERK/MAK信号通路并借由β6-ERK2直接连接上调MMP-9、Bcl-2和下调Bax蛋白表达,通过MMP-9诱导侵袭呈现恶性生物学表型,通过调节Bcl-2/Bax传达亚致死损伤修复信号,可能通过抑制线粒体凋亡途径并最终保护结直肠癌细胞耐受电离辐射诱导的凋亡。本研究明确了整合素β6介导结直肠癌放疗抵抗的作用和具体信号传导通路,加深了对整合素αvβ6的认识,探讨了其发挥作用的具体分子机制,从而丰富了结直肠癌放疗抵抗相关研究的理论知识,并有希望为结直肠癌的新型靶向辅助放疗提供了确切的作用靶点与理论依据。