【摘 要】
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羊乳因为其丰富的营养价值和易于消化吸收且不易引起过敏等特点,在国内外市场上广受消费者的青睐。但是由于羊乳的价格往往高于牛乳,许多商家常常在羊乳制品中掺入牛乳以此来牟取利益。为了维护消费者的利益以及提高市场羊乳制品的监管水平,本课题基于Taq Man探针技术开发了一种实时荧光定量PCR检测试剂盒,为鉴别羊乳制品中的掺假现象提供了一种可靠工具。首先对DNA提取方法进行了优化,实验结果表明利用异硫氰酸胍
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羊乳因为其丰富的营养价值和易于消化吸收且不易引起过敏等特点,在国内外市场上广受消费者的青睐。但是由于羊乳的价格往往高于牛乳,许多商家常常在羊乳制品中掺入牛乳以此来牟取利益。为了维护消费者的利益以及提高市场羊乳制品的监管水平,本课题基于Taq Man探针技术开发了一种实时荧光定量PCR检测试剂盒,为鉴别羊乳制品中的掺假现象提供了一种可靠工具。首先对DNA提取方法进行了优化,实验结果表明利用异硫氰酸胍-磁珠法可以快速的从不同乳制品中获得高质量的样本DNA,其A260/A280约为1.6~1.9。并且确定了液态奶、乳粉类、固体奶片类,奶酪类的最低用量分别为500μL,20 mg,50 mg,50 mg。然后实验依据牛、羊线粒体16S r DNA的基因差异,在保守区域设计了牛和羊通用引物,在其可变区域设计了特异性探针,并利用人工构建的非靶标序列为扩增内标,建立三重实时荧光定量体系。通过反应体系优化实验得出牛羊通用引物的最佳工作浓度为0.25μM,牛源性探针和羊源性探针最佳工作浓度分别为0.1μM和0.2μM,内标质粒的最适添加量为107 copies。所构建体系对牛和羊DNA的最低检出限均可达到1 pg,在模拟混合样本的检测中对牛的相对灵敏度约为1%,且试剂盒具有良好的重复性和稳定性,经过反复冻融10次后,组间CV值小于1%,在避光冻存条件下可以稳定保存6个月。从网店购买了八种不同的羊乳制品,进行了真实性分析,检测结果表明此次购买的羊乳制品中掺假率高达87.5%。
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