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前言急性肺损伤(ALI)是由各种肺内外致病因素引起的急性进行性呼吸衰竭。主要病理特征是弥漫性肺泡毛细血管膜损伤、通透性增高和肺水肿。目前国内外学者认为肺泡-毛细血管膜通透性增高是其主要发病机制。内毒素直接或间接损伤肺泡上皮和肺血管内皮细胞,导致肺泡-毛细血管膜通透性增加。肺毛细血管内皮的孔径是肺泡上皮孔径的约4倍即肺泡上皮较肺毛细血管内皮更为致密,故研究肺泡上皮屏障有着更为重要的意义。TJ主要存在于上皮细胞和内皮细胞间的连接复合体中形成环绕细胞的物理屏障结构。重要的TJ有Zo-1和闭锁蛋白(Occludin)等。目前国内尚无关于ALI时紧密连接蛋白损伤的研究报道。我们探讨内毒素引起肺泡上皮细胞Zo-1和Occludin蛋白表达变化规律,以推测紧密连接蛋白在ALI发生中的可能机制,并为早期ALI治疗提供理论依据。材料与方法一、实验材料1、实验动物SD(Sprague-Dawley)大鼠,雄性,体重220～270g,共30只。2、主要试剂LPS:E.coli,内毒素055:B5 LPS;购于Sigma.Co。一抗:山羊抗鼠Occludin多克隆抗体,山羊抗鼠Zo-1多克隆抗体,美国Santa Cruz公司。二抗:兔抗山羊抗体,胃蛋白酶,DAB显示剂。免疫组化试剂盒包括正常血清封闭液。源于北京中杉金桥生物技术有限公司。3、主要器材电热恒温培养箱:DNP-9262型。源于上海精宏实验设备有限公司。微波炉:WD-700型。源于LG电子天津电器有限公司。显微镜:CX-41RF型。源于菲律宾。显微图像分析系统:Meta Morph/DP10/BX41,由UIC/OLYMPUS,US/JP生产。多道生理信号采集处理系统RM 6240 BD型源于成都仪器厂制造。二、实验方法1、实验动物分组及动物模型制备30只SD雄性大鼠,随机分成3组:正常对照组,LPS4h组,LPS24h组,每组10只大鼠。10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后,暴露气管,实验组气管内滴注LPS 0.5ml/kg(浓度为LPS 200μg/ml),对照组气管内滴注NS0.5ml/kg。LPS给予后观察4h组为LPS4h组,观察24h组为LPS24h组,NS对照组观察24h。2、实验动物的观察和标本的采集当大鼠观察结束时,分别用10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉。分离颈动脉,用套管针进行颈动脉插管。经压力换能器与多道生理信号采集处理系统相连,记录血压。然后,暴露气管并开胸,观察肺形态。在左心耳处剪约2mm小切口,于右室经肺动脉流出道插入肺动脉套管针,灌注加入肝素的生理盐水,直至将肺血管床冲洗干净,肺组织洁白。将左主支气管结扎,取左下肺组织(约1cm×1cm×0.5cm)浸泡固定于4%多聚甲醛中24h,常规脱水、包埋、制成蜡块,用于HE染色及免疫组化染色。余下的左肺组织称湿重(W)后置60℃温箱,7天后称干重(D),求得湿重/干重比(W/D)。3、肺组织常规病理分析肺组织腊块切成4μm切片后经不同浓度酒精梯度常规脱蜡至水,HE染色。4、Occludin,Zo-1在肺组织中的免疫组化染色肺组织蜡块切成4μm切片后严格按免疫组化试剂盒说明书操作。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替第1抗体作为阴性对照。结果通过图像分析,测出Occludin,Zo-1表达的平均灰度A。三、统计学分析计量资料采用(?)±s表示,采用SPSS13.0统计分析软件进行方差分析及q检验,p＜0.05为差异有统计学意义。结果一、肺组织的病理改变NS对照组:肺脏大体观察无明显异常改变。光镜可见肺泡结构完整,未见明显病变。LPS4h组和LPS24组:大体观察可见所有肺组织均有肿胀,肺表面色泽暗红。光镜可见肺泡腔内有明显的中性粒细胞浸润及少量的红细胞渗出。LPS4组较LPS24h组肺泡间隔增厚,有更多红细胞及巨噬细胞浸润。二、肺组织湿重/干重(W/D)及血压肺W/D表明:肺损伤4h组大鼠(6.65±0.58)与对照组(4.50±0.42)相比出现明显的差异(p＜0.05),肺损伤24h组(4.82±0.55)与对照组相比无明显差异(p＞0.05)。说明肺损伤4小时组肺水肿最明显。LPS给予后血压均低于对照组,以肺损伤4h组血压(64±6.0)下降最明显与对照组(96±5.0)相比具有显著差异(p＜0.05);肺损伤24h组血压(85±6.0)与对照组无明显差异(p＞0.05)。三、Occludin在肺组织中的表达Occludin在正常对照组大鼠肺泡上皮细胞大量表达呈棕黄色。Occludin表达在LPS4h组(20.5±3.68)明显减弱与对照组(40.97±8.01)相比具有显著差异(p＜0.05)。Occludin表达在LPS24h组(32.77±3.40)与LPS4h组相比有所恢复但与对照组相比仍有显著差异(p＜0.05)。四、Zo-1在肺组织中的表达Zo-1在正常对照组大鼠肺泡胞浆大量表达呈棕黄色。肺泡胞浆Zo-1表达在LPS4h组(20.77±5.08)明显减弱与对照组(48.63±5.15)相比具有显著差异(p＜0.05)。肺泡胞浆Zo-1表达在LPS24h组(39.20±8.42)与LPS4h组相比有所恢复并且与对照组无显著差异(p＞0.05)。结论急性肺损伤早期即出现紧密连接蛋白表达减少,Occludin和Zo-1表达与急性肺损伤发生密切相关。