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缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)是威胁人类健康的主要杀手之一,具有极高的致死率和致残率[1]。尽管多数患者能从经皮冠状动脉腔内血管成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)、冠状动脉搭桥手术(coronary artery bypass graft,CABG)及药物治疗中获益,但仍然有相当数量的慢性缺血性心脏病(chronic ischemic heart disease,CHD)患者,他们因为冠脉病变严重、弥漫等各种原因无法进行手术治疗,且药物治疗效果往往不理想[2]。这部分CHD患者目前缺乏有效的干预措施,临床上也被称作“无选择权”患者。干细胞研究的进展为这类患者带来了希望。近年来,大量基础[3,4]和临床研究[5,6]显示,干细胞移植可以减少心肌细胞凋亡,促进新生血管形成,改善心室重构,提高心功能,显示出良好的应用前景。其中间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因其来源广泛,操作简便,具有免疫豁免效应等优势而受到研究人员的广泛青睐。现有的研究表明,MSCs治疗急性心肌缺血安全有效。但MSCs在治疗慢性心肌缺血方面的研究尚少。目前,国内外尚未见到在大动物模型上研究联合移植MSCs治疗CHD的报道。MSCs有多种来源,现有的研究多采用骨髓来源间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)。但BM-MSCs具有取材有创伤,年龄较大供体的MSCs增殖能力有限等缺点[7,8]。因此,研究人员开始探讨多种其他来源MSCs治疗心脏病的可行性。其中脐带来源间充质干细胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs)因其取材无创伤,无伦理限制,细胞增殖和分化能力强,能分泌多种促血管生成因子等优势,成为替代BM-MSCs的较为理想的细胞来源[9]。目前已经有大量采用UC-MSCs治疗多种疾病的临床前或临床研究报道,包括肝硬化[10]、糖尿病[11]、系统性红斑狼疮[12]、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)[13]等,但在心脏病的研究方面尚处于起步阶段。目前尚未见到采用UC-MSCs治疗CHD的研究报道。因此,本研究拟建立猪慢性缺血性心脏病动物模型,通过冠脉结合两次静脉输注的方式移植异体猪骨髓来源间充质干细胞(pig bone marrow-derived mesenchymal stem cells,p BM-MSCs)和人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)进行干预,采用冠脉造影、心脏超声、单光子发射计算机断层成像(single-photon emission computed tomography,SPECT)和病理组织学等方法综合评价骨髓和脐带来源MSCs移植对CHD的治疗作用,从而为今后的临床应用提供依据。本研究首先采用Ficoll密度梯度法分离p BM-MSCs,相差显微镜观察显示,p BM-MSCs呈梭形,旋涡状或鱼尾状生长。流式检测结果表明,p BM-MSCs表达CD44、CD29、CD90,而CD14、CD34、CD45、CD166、HLA-DR表达呈阴性。诱导分化实验发现,p BM-MSCs能够分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞。然后我们采用酶消化法分离h UC-MSCs,相差显微镜下观察,细胞呈梭形,旋涡状或平行排列,流式检测结果显示,细胞表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和HLA-ABC,而CD34、CD45、HLA-DR表达呈阴性。诱导分化结果显示,h UC-MSCs可向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的分化。最后我们着重探讨了p BM-MSCs和h UC-MSCs对慢性缺血性心脏病大动物模型的治疗作用。选取30只小型猪,将Ameroid动脉缩窄环置于猪左冠回旋支(left circumflex coronary artery,LCX)建立慢性缺血性心脏病动物模型,4周后通过冠脉造影和心电图对模型进行评价;存活的20只动物随机分为p BM-MSCs组(n=8)、h UC-MSCs组(n=6)和对照组(n=6),治疗组采用冠脉结合两次静脉输注的方式移植经过CM-Di I标记的p BM-MSCs和h UC-MSCs进行干预,对照组则输注生理盐水。细胞移植前和移植后4周,冠脉造影检测冠脉侧枝循环,心脏超声检测心功能和心脏结构指标,SPECT检测心肌血流灌注。动物处死后取心脏行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride,TTC)染色计算梗死面积,并选取梗死边缘区的组织制备病理切片,检测心肌细胞纤维化、凋亡、新生血管形成等情况,并观察移植细胞的植入和转归。建模后4周,存活的20只猪冠脉造影显示LCX均完全闭塞,心电图可见Ⅰ、AVL和(或)Ⅱ、Ⅲ、AVF和(或)V4-V6导联ST段压低和(或)T波改变。细胞移植后4周,冠脉造影结果显示:对照组和细胞治疗组均有侧枝血管形成,但与治疗前相比,对照组Rentrop评分增加无统计学意义,而p BM-MSCs组和h UC-MSCs组结果则有显著差异(p<0.01),表明细胞移植促进了侧枝循环的形成;与对照组相比,p BM-MSCs组和h UC-MSCs组侧枝血管计数结果有显著差异(P<0.05),但两个细胞治疗组之间无明显差别。心电图结果表明,p BM-MSCs和h UC-MSCs移植组心率(heart rate,HR)较治疗前无明显变化,而对照组HR明显增加(P<0.01)。心脏超声:细胞治疗组的左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)较治疗前均有升高,p BM-MSCs组从53.91%±6.72%升至58.19±7.10%(p<0.05),h UC-MSCs组从56.12±2.86%升至61.32±3.23%(p<0.05),而对照组的LVEF较治疗前下降;与对照组相比,细胞治疗组LVEF的升高具有显著差异(P<0.05),但p BM-MSCs组与h UC-MSCs组间相比无差异;与对照组相比,两个细胞治疗组的梗死区收缩期室壁增厚率(systolic thickening fraction in the infarcted left ventricular wall,WTh F)升高均有统计学差异(P<0.05);此外,对照组的左室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume,LVESV)和左室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume,LVEDV)较治疗前均明显增大(P<0.05),而p BM-MSCs组和h UC-MSCs组治疗前后未见明显改变。SPECT结果显示:对照组和细胞治疗组心肌血流灌注均较治疗前有所改善;但p BM-MSCs组(p<0.01)和h UC-MSCs组(p<0.05)改善较对照组明显,且二者之间无显著差异。病理组织学结果显示,TTC染色:p BM-MSCs组和h UC-MSCs组梗死面积分别为7.89±2.62%和8.35±1.88%,比对照组(14.52±4.85%)显著减小(p<0.05);HE染色:细胞移植组炎性评分显著低于对照组(p<0.05);Masson三色染色显示细胞移植组的胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)明显小于对照组(p<0.05);血管计数:p BM-MSCs和h UC-MSCs移植组微血管密度显著高于对照组(p<0.05);TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase d UTP nick end labeling)法检测凋亡,p BM-MSCs组(11±3cells/100 cells)和h UC-MSCs组(13±4 cells/100cells)凋亡的心肌细胞数量明显少于对照组(24±3 cells/100 cells)(p<0.01)。荧光显微镜下梗死边缘区可见有CM-Di I标记的细胞,免疫荧光染色显示p BM-MSCs组和h UC-MSCs组均可见移植后的MSCs部分分化为血管内皮细胞,未观察到其向心肌细胞分化。RT-q PCR显示,与对照组相比,p BM-MSCs组的促血管生成素(angiogenin,Ang)表达增高(p<0.05),h UC-MSCs组的Ang(p<0.01)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)(p<0.05)表达增高,而白介素-6(interleukin-6,IL-6)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、胸腺肽β4(thymosin beta 4,Tβ4)的表达无显著改变。本研究成功分离培养了p BM-MSCs和h UC-MSCs;并将Ameroid动脉缩窄环置入猪LCX成功建立猪慢性缺血性心脏病模型;经冠脉结合两次静脉输注p BM-MSCs及h UC-MSCs治疗研究结果表明,p BM-MSCs及h UC-MSCs均能有效减少梗死面积,减轻炎症反应,减少心肌细胞凋亡和心肌纤维化,促进侧枝循环形成及血管新生,改善心肌血流灌注,改善心室重构,提高心功能,且两种细胞的治疗作用无显著差异。