近年来,随着动物细胞培养技术的迅猛发展,其在生物医药生产方面的灵活性、高效性、安全性等优势日渐突显,正被广泛应用于包括病毒类疫苗在内的多种生物医药产品的生产,并将有望取代传统工艺而成为病毒疫苗的主流生产方式。然而以流感疫苗为例,采用动物细胞培养获得的病毒增殖效率与传统鸡胚法相比优势尚不明显,尤其在高密度细胞培养过程中流感病毒的增殖效率更是低下,使这种工艺的经济性面临严峻挑战。为此,迫切需要研究和认识细胞生理状态、培养环境营养供给和操作参数、病毒感染参数等条件对细胞生长、密度维持和病毒感染复制的影响,以优化细胞培养和流感病毒生产工艺,提升病毒生产效率在基于动物细胞大规模培养技术的流感疫苗生产工艺中,细胞生长和病毒扩增效率是决定病毒总产量的两个关键因子,因此本文首先从这两方面入手考察了细胞贴壁基质(微载体)和生长促进物(血清)对细胞生长的影响,以及病毒感染参数对病毒增殖的影响,初步建立了适合MDCK细胞生长和流感病毒生产的工艺。此外,由于病毒的增殖与细胞的生理状态之间具有直接的关系,而且培养过程中的营养和环境条件是影响细胞生理状态的重要因素。因此,本文继而通过深入考察培养环境的营养供给和生物反应器操作参数对病毒增殖的影响,以认识病毒增殖对培养环境营养供给和参数控制条件的需求,在此基础上进一步优化维持培养基的营养组成和生物反应器的操作参数,建立能够满足未来大规模工业化生产需要的MDCK细胞高密度培养和流感病毒高效生产工艺。本文首先通过考察微载体和血清对细胞生长的影响以及感染参数对病毒生产效率的影响,确定了基于MDCK细胞培养的流感疫苗生产的基本工艺。研究表明,Cytodex-1和Cytodex-3两种微载体均能支持MDCK细胞正常贴附生长,胎牛血清(FBS)支持细胞生长的作用显著优于新生小牛血清(NBS)。以2 g/L浓度的Cytodex-1或3 g/L的Cytodex-3为贴附基质,以DMEM为基础培养基,添加7.5%(v/v)的FBS便能确保MDCK细胞正常生长,细胞密度可达5.50×106 cells/ml;事关流感病毒感染复制的三个关键参数TPCK-胰酶浓度、MOI和TOI均对病毒增殖具有显著影响,采用5.0 mg/L的TPCK-胰酶浓度、0.01的MOI和72 h的TOI较为适宜；据此建立了基于MDCK细胞生物反应器培养的流感病毒基本生产工艺,流感病毒HA滴度值达到210.13±0.18 HA units/50μl,单位细胞病毒产率Svy为(6.09±0.44)×103virions/cell。上述生产工艺虽可满足工业化生产的基本需求,但其生产效率仍有较大提升空间。为了进一步提高生产效率,本文继而通过考察维持培养基的关键组分对产毒期MDCK细胞密度维持、代谢和病毒增殖的影响,分析了病毒增殖过程对营养代谢的需求,进一步优化了维持培养基。研究表明产毒期的换液操作可显著提高单位细胞的病毒产率,由此可知在细胞产毒阶段改善培养环境的营养供给对病毒高效增殖尤为重要。与此同时,本文发现在产毒期适当提高葡萄糖浓度可显著促进产毒期的细胞密度维持,提高谷氨酰胺浓度既有利于产毒期细胞密度的维持亦可促进病毒增殖,提高其它氨基酸浓度亦可促进病毒增殖。另外,本文发现在产毒期添加0.75 mmol/L浓度的丁酸钠(NaBu)可显著提高流感病毒的产率,其作用机制在于获得较高的Go/G1细胞比例的同时维持较低的细胞凋亡比例,从而有利于病毒感染和进入细胞,且延长病毒增殖时间。在此基础上开发和优化的维持培养基Optimized-MM,能显著提高流感病毒的生产效率,其中流感病毒的HA滴度、HA抗原蛋白浓度和Svy分别提高了(159.37±31.82)%、(34.29±2.03)%和(166.17±37.50)%。此外,为了优化流感病毒增殖的环境控制参数,本文还考察了细胞生长期和产毒期的生物反应器控制参数(DO、pH和温度)对流感病毒增殖的影响及其作用机制。研究发现,在本文考察的实验范围内,pH值和温度对流感病毒增殖效率的作用十分显著,产毒期7.2的pHpi值可显著提高流感病毒的增殖效率,在该条件下可以获得较高的Go/G1期细胞比例和较低的细胞凋亡比例,有利于提高病毒RNA酶量和减少抑病毒蛋白对病毒RNA酶活性的抑制作用,从而有利于病毒感染和病毒RNA合成,并在胞内实现大量增殖。将细胞生长期和产毒期的温度均控制为35℃时可显著提高流感病毒的增殖效率,实验发现在该条件下接毒前和产毒期间的细胞均可维持较高的G0/G1期细胞比例和较低的凋亡比例,可提高病毒RNA酶量和削弱抑病毒蛋白对病毒RNA酶活性的抑制作用,还可以增强胞内促病毒蛋白对病毒RNP出核转运的促进作用,从而有利于病毒感染、RNA合成和RNP的出核转运,在胞内实现病毒的高效增殖。最后,本文据上述研究进一步确定了培养环境的营养供给条件和生物反应器操作参数,进而在上述基本工艺的基础优化并建立了基于MDCK细胞培养的流感病毒生产新工艺。结果表明,虽然优化后MDCK细胞在生长期达到的细胞密度以及产毒期的密度维持与基本工艺并无明显差异,但在最后优化并建立的工艺中流感病毒的HA滴度、HA抗原蛋白浓度和Svy分别达到213.00±0.00 HA units/50μl、6.77±0.37μg/ml和(41.31±0.98)×103 virions/cell,分别是基本工艺的7.36±0.90、1.89±0.90和6.83±1.02倍,且病毒的稳定性也表现更好。通过本文的研究,开发了基于MDCK细胞大规模培养的流感病毒疫苗高效生产工艺,为流感病毒疫苗的工业化生产奠定了基础。另外,对培养环境营养组成和环境控制参数影响流感病毒增殖作用机制的研究所获得的深刻认识,对以细胞大规模培养技术为基础的各类病毒疫苗生产工艺的开发和优化均具重要借鉴作用。