论文部分内容阅读
半夏（Pinellia ternate（Thunb.）Breit.）为天南星科半夏属的干燥块茎,由于其具有燥湿化痰、抗溃疡、降血脂、解毒等药理功效,因此倍受关注。然而,随着半夏人工种植规模不断扩大,半夏病毒病害也愈发严重,已对半夏产量和品质造成严重影响。目前,进行喷洒化学源农药和培育抗性品种被认为是两条有效抗病途径,但其具有环境污染和工作量繁重等弊端。有研究表明源于革兰氏阴性植物病原细菌的过敏蛋白（Harpin）具有提高植物广谱抗性的作用,而且实验室前期试验将Hpa1（一种Harpin蛋白）喷施于半夏叶片上,发现Hpa1能够显著缓解半夏花叶症状,说明Hpa1能激发有效抗性,但其抗病分子机理目前尚不清楚。因此,本试验拟在明确Hpa1最适有效剂量的基础上,从抗病相关防御酶活性、抗病相关物质含量、植物信号传导途径和抑制病毒复制等方面来解析其抗性机理;同时通过对不同诱导期半夏的田间发病状况和系统病叶病毒含量进行统计和检测,探索其在田间应用的稳定性。本试验主要研究结果如下:1.采用植物组织离体培养技术对半夏进行脱毒培养。以半夏茎尖为外植体,在单因素试验基础上,通过设计L9（32）正交试验,确定茎尖愈伤组织诱导的最适培养基,并对脱毒苗病毒含量进行分子检测。正交试验得出诱导愈伤的最佳培养基配方为:MS+1.5 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine,6-BA）+2.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D）+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖,并可一次性成苗。通过斑点酶联免疫吸附法（Dot enzyme-linked immunosorbent assay,Dot-ELASA）和反转录聚合酶链反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）对该组培脱毒苗进行检测后,大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）脱毒率均达到100%。2.利用酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELASA）的检测手段,从预防和治疗效果两方面测定了Hap1的抗TMV活性及最佳有效剂量。结果显示,相较于对照组,Hap1具有明显的抗TMV活性,且其预防效果强于治疗效果,说明Hap1能以更强劲的方式阻止TMV侵染半夏。其次,当Hap1浓度为15μg/mL时,Hap1的防治效果最佳,预防效果高达71.4%,治效果高达55.4%。3.用15μg/mL Hap1激发诱导抗性,于诱导后1 d接种TMV,对接种后不同时间点半夏防御相关酶活性和部分抗病相关物质含量进行了测定。结果表明Hap1诱导后,半夏体内的多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）、过氧化物酶（Peroxidas,POD）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性以及过氧化氢（Hydrogen peroxide,H2O2）含量显著上升,丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量显著下降。4.用15μg/mL Hap1激发诱导抗性,诱导后1 d接种TMV,利用荧光显微技术对攻毒后不同时间点的半夏进行组织病理学检测。结果显示,在不同处理中H2O2、胼胝质和侵染位点酚类物质的积累模式基本相同,都呈先增加后减少的趋势。但相较于对照组,经Hap1和宁南霉素诱导的半夏叶片中这三种物质以更快更多的方式积累,可以加强半夏对TMV的抗性。5.用15μg/mL Hap1诱导激发抗性,诱导后1 d接种TMV,利用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）技术对植物信号传导通路中的防御相关基因进行定量检测。结果显示,经Hap1和宁南霉素诱导后,半夏体内的PR1与PR5（与水杨酸（Salicylic acid,SA）通路相关的两个基因）和PR3与PDF1（与茉莉酸/乙烯（Jasmonic acid/ethylene,JA/ET）通路相关的两个基因）基因的表达量都显著提高,且两者差异不显著。对外源Hap1介导的半夏而言,在接种TMV 4 d后,PR1的相对表达量达到峰值,比对照组高4.3倍;接种6 d后PR3的相对表达量达到峰值,比对照组高2.9倍;PR5和PDF1.2以更快的模式诱导抗性,并且相对表达量均在接种2 d后达到最大值,分别比对照组高2.8和2.4倍。6.基于病毒在大田中侵染植物时间的不确定性,本试验以15μg/mL Hap1为激发诱导剂,于诱导后不同时间点进行攻毒,通过对田间半夏发病状况和系统病叶病毒含量的统计和测定,对Hpa1诱导TMV抗性的稳定性以及田间应用的可行性进行分析。结果显示,将Hpa1喷施到半夏叶片上2 d后,用TMV进行攻毒试验,半夏叶片的发病症状最轻,其防控效果高达85%,同时qRT-PCR检测结果也显示当间隔期为2 d时,系统病叶TMV外壳蛋白（coat protein,CP）的相对表达量最少,比对照组低11.52倍。另外,相对于对照组,外源Hpa1在整个试验周期的防治效果都显著高于对照组,且高防护效果持续10 d左右。