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我国研制成功的马传染性贫血驴白细胞弱毒(equine infectious anemia virus donkey leukocyteattenuated,EIAVDLA)疫苗成功控制了马传染性贫血病在我国的流行.该疫苗具有良好的安全性和有效性,成为研究包括人艾滋病病毒在内的慢病毒疫苗的良好自然动物模型.EIAV弱毒疫苗研制成功的路线是:将一株来源于马体的EIAV强毒(辽毒株、EIAVL)经过驴体连续传代100余代使病毒毒力增强后获得了驴强毒株(EIAVD,对马和驴90/致死率),然后将驴强毒株通过驴白细胞体外连续培养驯化120代,使病毒毒力丧失的同时保持了良好的免疫原性,最终培育成功了EIAV驴白细胞弱毒疫苗(EIAVDt<,DLA>).将驴白细胞弱毒疫苗进一步通过驴胎皮肤细胞继代,又获得比驴白细胞弱毒疫苗免疫保护效果更好的驴胎皮肤细胞(fetal donkey dermal cells,FDD)弱毒疫苗. 前病毒DNA基因组两端是长末端重复序列(LOng terminal repeat,LTR),LTR含有控制病毒RNA转录的启动子和增强予.LTR是基因组变异率最高的区域.
本研究对驴白细胞弱毒疫苗株(EIAVDtA)及其在驴胎皮肤细胞上传代获得的各代次驴胎皮肤细胞弱毒(第1-26代EIAVFDD)LTR进行测序分析及LTR的启动子功能比较.EIAV以准种形式存在,EIAVDLA、EIAVFDD LTR存在多种类型,一些类型占主要优势.EIAV<,DLA>LTR按负调节区(NRE)序列不同可分为四种类型:NRE I型与强毒株NRE区长度相同但存在点突变现象,占EIAV<,DLA>LTR的1/3:NRE Ⅲ型的NRE有17nt插入、10nt缺失,占EIAV<,DLA>LTR的2/3,而只插入17nt的NRE Ⅱ型、只缺失10nt的NRE Ⅳ型每种类型只检测到1个克隆.增强子区部分克隆有一段16nt的插入序列,其中包含1个Pu.1细胞转录因子结合位点.EIAV<,DLA> LTR转录起始位点分为GGTC、AAAC、.AGAC和GAAC等四种类型,在所测序的21个克隆中所占比例分别为23.8/、47.6/、14.3/和14.3/.强毒株的转录起始位点为GGAC.启动子活性比较实验说明负调节区的插入序列对LTR的启动子活性有一定抑制作用,增强子区插入序列对LTR的启动子活性有一定增强作用,但均未达到显著性差异.转录起始位点对LTR启动子活性大小的影响顺序为:GGTC>AAAC>AGAC>GGAC,但差异不显著.第13、26代EIAVF<,FDD> LTR的启动子活性在马巨噬细胞和驴胎皮肤细胞中显著高于EIAV<,DLE>、EIAVD LTR的启动子活性,EIAVI<,D>LTR.的活性最低.疫苗培育过程中不同阶段EIAV随着病毒毒力的降低,LTR的启动子活性逐渐增加.实验表明L,TR是EIAV细胞嗜性及毒力的影响因素之一.
EIAV<,DLA>在驴胎皮肤细胞传代过程中LTR.负调节区也发生了明显变异.第10代EIAV<,FDD>LTR开始出现lInt的插入序列(GATGACTAGCT、):第13代插入序列发生突变(CCCTTATGACTAGCT),但不占主要优势,在第23代含有这段插入序列的LTR序列成为绝对优势的类型;第21代EIAV<,FDD> LTR 49nt后缺失了CTCTCA.第23代LTR序列的第24-63nt有10个A-G的突变,在第23、26代LTR序列中占主要优势.由于大量点突变的出现,使第23代LTR的第54-68nt与第70-83nt形成不完全重复.LTR的启动子活性比较实验说明:随着EIAV<,DLA>在驴胎皮肤细胞中传代次数的增加,EIAV<,FDD> LTR的启动子活性逐渐增强,但差异不显著(P>0.05).病毒感染细胞提供Tat,LTR启动子的激活活性是基础活性的1.5-2.7倍.EIAV<,DLA> LTR启动子活性在皮肤细胞中显著低于EIAV<,FDD>LXR,P<0.01.
用PCR方法对第19、26代EIAV<,FDD>前病毒全基因进行分段克隆与测序.对无免疫保护性的第19、26代EIAV<,FDD>全基因序列与四个参考毒株比较分析发现,gag只有1个氨基酸与四个参考毒株不同,但与国外毒株1369株相应位置氨基酸相同;pol复制酶发生8处氨基酸变异,有3处氨基酸变异导致疏水性改变.env基因发生了多处稳定性点突变,Env的gp90缺失了2个N-连接糖基化位点,主要中和决定区有1个氨基酸突变,但亲水性没有改变.gp45与EIAV<,FDD>疫苗株一样有 TM 截短现象.S1 基因编码的 Tat 蛋白氨基酸序列未发生变异.S2蛋白氨基酸序列无变异.S3编码的Rev发生3处突变,有两处氨基酸的突变,其中1个氨基酸突变位点位于Rev功能的基本区,基本区前还出现一段26个氨基酸缺失,这3个突变位点对Rev的功能及病毒毒力的影响有待于进一步研究.
将第26代EIAV<,FDD>弱毒接种马体后,病毒载量处于极低水平,接近检测下限,诱导的抗体反应微弱,接种后6个月内未检测到LTR序列的变异.