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猪链球菌(Streptococcus suis)是一种革兰氏阳性菌,有35个血清型,其中SS2致病力最强,可引致猪的急性败血症及相关人员感染而死亡,造成较大的经济损失,产生重大的社会影响,成为公共卫生突发事件,倍受世人关注。为了进一步了解SS2免疫及致病机制,本文使用蛋白组学的方法对其进行研究,以期发现新的免疫原性蛋白及寻找新毒力标志物。为了高通量地筛选亚单位疫苗的候选物,本试验采用了免疫蛋白组学的方法,对SS2的可刺激宿主产生抗体的分泌蛋白(extracellular proteins)、膜相关蛋白(membrane-associated proteins,MAP)和细胞壁蛋白(cell-wallproteins,CWP)分别进行了筛选。应用免疫蛋白组学方法,分析SS2的分泌蛋白,以SPF微型猪SS2康复血清为一抗,HRP-SPA为二抗,对转移到PVDF膜的中国分离株ZY05719及HA9801的上清蛋白,检测具有免疫原性的蛋白。将重复胶上与之对应的蛋白点进行MALDI-TOF-MS分析。共鉴定出7个免疫原性蛋白,其中包括溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,MRP)、胞外因子(extracellurlar factors,EF)和溶血素(suilysin,SLY),同时还发现4个以前未被报道的免疫原性蛋白。用Triton X-114法富集SS2 HA9801的膜相关蛋白。作免疫蛋白组学分析,以SPF微型猪SS2免疫血清为一抗,HRP标记的羊抗猪为为二抗,对转移到PVDF膜上的HA9801膜相关蛋白进行检测。总共发现13个免疫原性的蛋白,将重复胶上相应的点进行MALDI-TOF-MS检测,全部成功地被鉴定出来,其中7个为首次报道。用变溶菌素法提取SS2 HA9801的细胞壁蛋白。应用免疫蛋白组法,以SPF微型猪的免疫血清为一抗,HRP标记的羊抗猪为二抗,对转印到PDVF膜上的CWP蛋白进行检测,并将重复胶上相应的点进行MALDI-TOF-MS检测。共有有11蛋白点个被检出有免疫原性,用质谱鉴定属于7种蛋白,其中4种为首次报道。自然界中存在的SS2包括有强毒株和无毒株。本试验采用比较蛋白组学的方法,比较了SS2两株强毒株(HA9801和ZY05719)与无毒株T15蛋白二维表达图谱,以期确认和发现SS2毒力标志物。在对强毒株(HA9801和ZY05719)与弱毒株(T15)之间的分泌蛋白的二维电泳图谱比较中,一共发现了九个差异点,其中的八个被生物质谱成功鉴定,其中包括包括MRP、EF、SLY。根据差异蛋白的基因合成引物,以三株SS2菌株DNA为模板进行扩增,其中有5对引物在三株细菌中均扩增出相应基因,一对引物均未扩出,二对仅在强毒株中扩增出。同样采用比较蛋白组学的方法,比较HA9801和ZY05719与T15菌体蛋白的二维表达图谱。在强毒株与弱毒株之间,一共鉴定出3个差异点。根据差异蛋白的基因合成引物,以三株SS2菌株DNA为模板进行扩增,PCR结果表明,此三种蛋白的基因仅在强毒株中分布。用前述的免疫蛋白组学方法,筛选到一种既存在于分泌蛋白中,也存在于膜相关蛋白中的免疫原性蛋白(HM3),用PCR扩增该蛋白的一段基因,定向克隆到表达载体pET-32a(+)中并转化入BL21(DE3)宿主菌。重组菌经IPTG诱导后的SDS-PAGE图谱在46kDa处出现融合蛋白的条带。Western-blotting表明,融合蛋白可被SPF微型猪抗SS2血清所识别,提示该融合蛋白可作为该菌的亚单位疫苗的候选物。