大豆对大豆花叶病毒抗病基因RSC3Q和RSC7Q的精细定位及抗病候选基因的鉴别

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大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)病是大豆生产上的一种世界性病害,对大豆产量和品质造成严重的影响。培育抗SMV病的品种是保证大豆稳产、优质、高产最经济、有效和安全的途径。本研究对黄淮和长江流域SMV流行株系SC3和SC7,进行抗性基因的精细定位,在此基础上结合转录组数据分析、基因组DNA重测序结果分析以及实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QRT-PCR)技术等对精细定位区段内的预测基因进行分析,以获得较可靠的抗病候选基因甚至抗病基因,主要研究结果如下:1、RSC3Q基因的精细定位及候选基因的鉴别本研究在目标区间内开发在亲本间表现稳定多态的新SSR标记(S-37,S-93,S-110和S-35)和InDel标记(K26-2,25-57,G25-19和G25-45)各4对。利用筛选到的交换单株和新开发的标记将13号染色体上的RSc3Q基因位点所在区间由65 1kbp缩小到标记S-110和BARCSOYSSR131136间约180kbp区间内,区间内预测的基因数目17个。其中的4个具有NBS-LRR结构域的基因(Glyma13g25920、Glyma13g25950、Glyma13g25970和Glyma13g26000)是对生物和非生物胁迫积极响应的基因。转录组数据分析表明这些基因在抗感近等基因系间表达差异显著;且重测序结果显示在抗感近等基因系间这四个基因与该区段内的其他基因相比单核苷酸差异较大,因此推测这4个基因是最可能的抗病基因。2、RSC3Q候选基因的克隆及生物信息学分析本研究对基因RSc3Q精细定位区间内的4个抗病候选基因Glyma13g25920、Glymal3g25950、Glymal3g25970和Glyma13g26000 的编码序列设计特异引物,进行PCR扩增。经序列比对和生物信息学分析,发现这4个基因所编码的蛋白质均不含有跨膜区,无明显的疏水结构域;除基因Glyma13g26000所编码的蛋白质含有信号肽序列外,其他3个基因编码的蛋白质均无信号肽序列;同源性分析发现,4个基因编码氨基酸序列的相似度较高,其中基因Glyma13g25920和Glyma13g26000氨基酸间序列相似度高达93.63%。4个候选基因的系统进化树分析结果表明,除基因Glyma13g25950与抗大豆细菌性斑点病(Pseudomonassyringaepv.glyciinea)基因母Rpg1-b亲缘关系较近外,其他基因均与大豆抗SMV的Rsv1位点内基因簇的基因亲缘关系较近。3、RSC7Q基因的精细定位及候选基因的鉴别本研究利用新开发的SSR和Indel标记(S-16,S-42,K-20和S-36)将13号染色体上的沿c7Q基因位点缩小到S-16和BARCSOYSSR131158间约250.6kbp区间内,该区段内共存在17个基因。在对生物和非生物胁迫响应的基因中筛选5个具有NBS-LRR结构域的基因和1个具有PK(Protein kinase domain)结构域的基因作为候选基因进行分析。QRT-PCR表达分析表明:基因Glyma13g26310、Glyma13g26420、Glyma13g26460和Glyma13g26530在抗感品种间诱导表达差异显著;且重测序结果显示在抗感近等基因系中这四个基因与该区段内的其他基因相比单核苷酸差异较大,因此推测这4个基因最可能为抗病相关基因。同时研究发现,接种SMV-SC7后,植物激素通路中关键基因GmPR1和GmNCED3在接种病毒的抗感品种间诱导表达差异显著,在抗病品种中GmPR1达到峰值时的表达量是对照的10倍左右而感病品种在选择的时间点与对照均无显著差异;基因GmNCED3在抗病品种中达到峰值时的表达量约是对照的3倍,而感病品种在选择的时间点与对照均无显著差异。因此推测大豆抗SMV-SC7最可能诱导SA和ABA激素通路参与抗病,且SA是主要的植物激素通路。
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