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目的首先明确Pae给药是否可以影响高血脂大鼠血脂水平,抑制炎性反应;进一步检测Pae-exo对RAECs的炎性反应的影响;最后探讨Pae-exo对RAECs是否通过调控mi R-223介导的NLRP3信号通路产生影响。方法采用高脂饲料喂养联合腹腔注射维生素D2复制高脂血症SD大鼠模型,采用酶法检测大鼠血清TC、TG含量,HE染色观察大鼠肝细胞脂质积累情况,超速离心法提取exo,透射电镜观察exo,Zeta view检测exo粒径,Western blot检测CD63、CD9、TSG101、Calnexin蛋白表达,HPLC检测exo中Pae含量。接着将大鼠血浆exo作用于原代RAECs细胞,免疫组化法检测第Ⅷ因子表达,免疫荧光显微镜观察RAECs对exo的摄取,CCK-8法检测RAECs活性,Elisa法检测IL-1β、IL-6水平,q PCR检测mi R-223表达,Western blot检测NLRP3、ASC、Caspase-1、ICAM-1蛋白表达。结果1丹皮酚抑制高血脂大鼠血脂含量及炎性介质水平实验采用高脂饲料喂养联合维生素D2腹腔注射建立高血脂大鼠模型,模型组大鼠血清TC、TG含量高于对照组;对照组大鼠肝脏细胞结构清晰,形态正常,中央有核,胞质均匀,无脂滴,模型组大鼠肝脏细胞排列紊乱,部分肝细胞肿胀,细胞核固缩,细胞内出现大量空泡样变性,为重度肝细胞变性,提示高脂模型建立成功。对各组血清脂质含量和炎症因子的检测表明,Pae可以减少高血脂大鼠血清TC、TG含量,降低血清IL-1β、IL-6水平。2外泌体提取鉴定为了验证exo的功能,我们提取了各组大鼠血浆exo,透射电镜观察到提取物呈双层膜茶托样结构,粒径检测显示粒子平均值和中位值都在110∽120nm左右,整体颗粒峰值在115 nm左右,粒子在液体中做布朗运动,蛋白分析提示样本中含有CD63、CD9、TSG101蛋白,但不含Calnexin蛋白,表明获得的提取物为exo。3 RAECs细胞提取RAECs细胞为本实验的基础细胞,我们采用预消化法进行提取,免疫荧光显微镜下观察到显蓝色荧光的细胞核和显绿色荧光的细胞质,通过软件merge后可以看到长梭形的细胞质包裹着细胞核,并且表达第Ⅷ因子的细胞达到95%,证明RAECs细胞提取成功。4 RAECs摄取外泌体为了确定exo作用于RAECs细胞的时间、剂量,我们将不同浓度范围的M-exo作用于RAECs细胞分别培养6,12,24,36,48h,检测细胞活性,做时效量效关系曲线,选定作用条件为40μg/m L 24h,后续实验均在此筛选条件基础上展开。为了证明RAECs可以摄取exo,我们将exo用PKH-67染色后,与RAECs共同孵育24h观察到,绿色荧光清晰分布于细胞质,用DAPI染色的细胞核显蓝色荧光,提示RAECs摄取了exo,后续研究有意义。5外泌体中丹皮酚含量测定及该含量对RAECs的影响我们采用HPLC法检测exo中Pae含量,以排除观察exo作用于RAECs时Pae的干扰,结果显示C-exo（C组来源exo,其余组别采用类似简写）、M-exo中未检测出Pae,各Pae-exo组检测出微量Pae。我们将该含量Pae作用于RAECs中发现RAECs存活率无显著变化,提示Pae-exo中Pae对RAECs活力无明显影响。6 Pae-exo升高RAECs存活率降低炎性反应对细胞存活率的检测,我们发现M-exo共孵育组RAECs较C-exo共孵育组存活率下降,Pae-exo共孵育组RAECs较M-exo共孵育组存活率则提升,并且随Pae给药剂量的增大细胞存活率上升;台盼蓝染色结果显示,M-exo共孵育组RAECs活性较C-exo共孵育组降低,Pae-exo共孵育组RAECs活性较M-exo共孵育组增加,同样该效果呈现剂量依赖型趋势,说明Pae-exo对RAECs的影响较M-exo小。Elisa法检测结果显示M-exo共孵育组RAECs较C-exo共孵育组IL-1β,IL-6表达上升,Pae-exo共孵育组RAECs较M-exo共孵育组IL-1β,IL-6表达下降,且随着Pae给药浓度的升高IL-1β,IL-6含量降低。提示Pae-exo降低RAECs细胞炎性反应。细胞动态分析仪实时检测分析得到,M-exo共孵育组RAECs较Pae-exo共孵育组抗性降低,粘附能力上升,Pae-exo共孵育组RAECs较M-exo共孵育组抗性增加,粘附能力减弱,且随着Pae浓度的增加,RAECs抗性增加,粘附能力降低。说明Pae-exo降低RAECs粘附能力。7 Pae-exo影响RAECs中mi R-223含量q PCR检测结果显示,C-exo组mi R-223含量高于M-exo,而Pae-exo组较M-exo组则有显著提高,且mi R-223在外泌体的表达呈浓度梯度升高。接着,我们转染mi R-223 mimics和mi R-223 inhibitors到RAECs中得到,与C-exo共孵育组比较,M-exo共孵育组RAECs mi R-223含量减少,mi R-223 inhibitors组也降低;与M-exo共孵育组比较,mi R-223 mimics组RAECs细胞mi R-223表达增加,Pae可呈浓度梯度升高mi R-223在RAECs的表达。8 Pae-exo通过升高mi R-223含量抑制RAECs炎性反应我们用各组exo与RAECs进行共孵育,同时转染mi R-223 mimics和mi R-223 inhibitors到RAECs中,我们发现与PBS组比较,C-exo组细胞IL-1β,IL-6分泌量无显著变化;M-exo组与C-exo组比,IL-1β,IL-6分泌升高,mi R-223inhibitors组较C-exo组IL-1β,IL-6表达也升高;Pae-exo组与M-exo组比,IL-1β,IL-6的含量有所降低,mi R-223 mimics组与M-exo组比,IL-1β,IL-6的含量也有降低,说明M-exo有明显的促炎作用,而Pae-exo对炎症反应的抑制作用可能通过mi R-223及其下游通路进行。9 Pae-exo通过mi R-223调控RAECs中NLRP3信号通路随后,我们验证了Pae-exo对mi R-223下游通路的调节作用,Western blot检测RAECs细胞显示,与C-exo比较,M-exo组和mi R-223 inhibitors组NLRP3、ASC、caspase-1、ICAM-1蛋白均高表达;与M-exo组比较,Pae-exo组和mi R-223mimics组NLRP3、ASC、caspase-1、ICAM-1低表达。说明Pae-exo可能通过mi R-223抑制NLRP3信号通路影响RAECs细胞炎性反应,增加细胞活性。结论1.丹皮酚可以抑制高血脂大鼠血脂含量,降低炎性反应,升高血浆外泌体中mi R-223含量;2.Pae-exo可以增加RAECs活性,降低炎症介质的表达,减弱粘附能力;3.丹皮酚可以通过升高高血脂大鼠血浆外泌体中mi R-223的含量,抑制下游NLRP3炎性小体信号通路,减轻炎症反应,减弱其粘附能力。