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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV),属于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的单股、正链RNA病毒。根据其基因组序列的差异,可分为欧洲型和美洲型。自1996年我国首次分离到美洲型CH-1a株以来,我国流行的PRRSV毒株均属于美洲型。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome , PRRS)不仅是我国猪群中常见的重要疫病,也是国家兽医行政部门规定的强制免疫的疾病之一。2006年春夏季节,我国南方大部分地区猪群出现了以高热、厌食或不食、眼结膜炎、咳嗽、气喘等呼吸道症状、后驱无力以致无法站立或摇摆等神经症状及高死亡率为主要临床特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征,该病已给养猪业造成了巨大的经济损失。经基因组序列分析得知,高致病性PRRSV为美洲型、且Nsp2基因序列缺失90nt的PRRSV变异毒株。目前,国内普遍流行的猪繁殖与呼吸综合征毒株均属于这两种毒株类型,且它们引起的临床症状相似,难于区分。鉴于上述情况,为了现地快速诊断猪繁殖与呼吸综合征并区分两种PRRSV毒株,建立鉴别诊断方法是十分必要的检测手段。本研究旨在建立一种二重实时荧光PCR方法,用于PRRSV高致病株和经典株的鉴别诊断。通过比较分析GenBank登陆的美洲型PRRSV毒株基因组序列,在保守的N基因设计通用引物,通过PCR扩增,可获得PRRSV高致病株和经典株的扩增产物;根据PRRSV高致病性和经典株Nsp2基因序列差异,设计一对鉴别引物,可以获得高致病性PRRSV的扩增产物,而对PRRSV经典株无扩增,从而建立一种能区分PRRSV高致病株和经典株的特异、敏感、重复性好的二重SYBR Green-I实时荧光PCR鉴别诊断方法。该方法通过两种毒株扩增产物Tm值的差异可完全将它们区分开来。用该方法检测乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV)和猪呼吸道冠状病毒(Porcine respiratory coronavirus, PRCV)均为阴性,表明该方法的特异性良好;敏感性试验结果显示,该方法的最低检出量为10 TCID50/mL;批内、批间重复性试验显示,其变异系数均低于0.3%,具有良好的重复性。应用该方法对人工感染动物样品进行检测,自感染后第3、5、7、10、14、21、28d分别采集动物全血,检测结果为:第3、5、7、10、14、21d样品均为阳性;第28d样品为阴性。二重实时荧光PCR方法是一种定性的诊断方法,为了满足对特定样品需进行定量检测的需要,建立了高致病性PRRSV的实时荧光定量PCR方法对二重实时荧光PCR方法予以辅助。在高致病性PRRSV Nsp2基因缺失区域两端设计一对引物,其扩增片段长度为843bp,对该核酸序列进行克隆,将其重组质粒测OD260,计算出其浓度,并进行梯度稀释,将其做为标准品,建立高致病性PRRSV SYBR Green-I实时荧光定量PCR方法,其相关系数(R2)为0.997。特异性试验显示,JEV、CSFV、FMDV和PRRSV经典株均无特异性扩增。该方法的敏感性可达10拷贝/μL。用1000、100、10拷贝/μL的标准品进行批内重复试验,其变异系数分别为1.57%、1.82%、0.76%;批间重复试验的变异系数分别为2.83%、3.28%、2.27%。试验结果表明,高致病性PRRSV SYBR Green-I荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。应用该方法对人工感染动物样品进行检测,其结果为:第3、5、7、10、14、21、28d样品均为阳性,与已建立的美洲型PRRSV荧光定量PCR检测结果一致。本研究成功建立了PRRSV高致病株和经典株二重SYBR Green-I实时荧光PCR方法及高致病性PRRSV SYBR Green-I荧光定量PCR方法,可快速鉴别PRRSV高致病株和经典株,且可对高致病性PRRSV进行定量检测,为开发检测试剂盒奠定了基础。