随着关节创伤的日渐增多,骨性关节炎(Osteoarthritis OA)已成为临床多发病和常见病,严重影响着人类健康。由于本病发展缓慢,病程长,早期不引起症状或症状轻微,易被人忽视,而现有的诊断方法主要依靠病人的临床症状和影像学表现,才能做出诊断。所以,在依靠放射学诊断前,我们不能早期作出诊断,进而阻断OA的发展,这反映了我们缺乏适当的方法监测关节软骨的健康程度。而且现在的诊断方法和关节病分期只适合于术前计划,并不适合于早期诊断和监测疾病发展。如何在创伤后早期诊断骨性关节炎,预测其发展趋势,早期治疗,从而延长关节使用寿命,减轻病人痛苦,是一个亟待解决的问题。毫无疑问,关节软骨在病理状态下,生化改变要早于形态学改变。寻求反映软骨生化改变的生物标记物将对早期诊断有极大的帮助。关节液中的生物标记物(Biomarker)能够直接反映患病关节的关节软骨生化改变,且不受身体其它部位关节软骨变化的影响,并且可以动态观察。以往的研究中,结合关节镜下软骨损伤评分,我们分析了多个关节液Marker,如：糖胺多糖、透明质酸、金属蛋白酶-3及其抑制剂-1、二型胶原羧基端肽、二型胶原螺旋肽等,虽然这些Marker被证明与软骨损伤相关,特别是软骨损伤早期,但是,由于个体差异较大,无法形成有效的标准应用于临床。如何减少个体差异的影响,以及发现新的、特异性高的Marker成为关节液研究的方向。关节镜下软骨损伤评分是界定软骨损伤的金标准,同时测定关节液中BM,能准确反映关节软骨的代谢情况,我们设计了如下研究内容：Ⅱ型胶原是关节软骨的特征性蛋白,围绕Ⅱ型胶原的代谢,一方面测定了关节液中Ⅱ型胶原螺旋肽的含量,研究其与关节软骨损伤程度间的关系；另一方面,同时测定关节液中其分解代谢产物Ⅱ型胶原羧基端端肽和合成代谢产物Ⅱ型前胶原羧基端前肽,通过观察在关节软骨损伤过程中二者之间的相互关系,研究Ⅱ型胶原代谢规律,早期诊断关节软骨损伤；对于新发现的关节液Marker(印度刺猬蛋白)进行含量测定,结合软骨损伤评分,研究其在早期诊断关节软骨损伤中的作用；通过表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术结合弱阳离子芯片,研究不同损伤程度下关节液蛋白的差异位点,建立早期诊断关节软骨损伤的差异位点模型,并为进一步蛋白组学研究提供方向；结合关节镜下软骨损伤评分和滑膜炎评分,分析滑膜炎和软骨损伤之间的关系。本课题分为五部分：第一部分关节液中Ⅱ型胶原螺旋肽(HELIX-Ⅱ)含量测定早期诊断关节软骨损伤目的：研究膝关节液中Ⅱ型胶原螺旋肽(HELIX-Ⅱ)的含量与关节镜下膝关节软骨损伤程度之间的关系,早期诊断关节软骨损伤。方法：收集2008年3月至2008年10月在山西医科大学第二医院骨科行关节镜诊治和膝关节置换术的膝关节疾病患者关节液83例,采用ELISA法检测其关节液HELIX-Ⅱ含量,依据Outerbridge软骨损伤评分标准评价软骨损伤程度,以损伤最重区域评分为最高评分,累加6个区域的评分即为该膝关节软骨损伤累计评分。结果：膝关节液中HELIX-Ⅱ含量与Outerbridge软骨损伤累计评分呈正相关(r=0.807,P<0.05),与Outerbridge软骨损伤最高评分呈正相关(r=0.794,P<0.05)；软骨损伤较重者(Outerbridge软骨损伤最高评分为2分、3分和4分)HELIX-Ⅱ的含量明显高于软骨损伤较轻者(0分和1分组)(P<0.05),而损伤较重者之间无明显差异。结论：膝关节液中HELIX-Ⅱ的含量可作为生物标记物来早期判断关节软骨损伤,特别是可以反映软骨是否有表面破裂这一病理变化,但不能用来监测病情发展。第二部分Ⅱ型胶原两种不同代谢BM同时测定早期诊断关节软骨损伤目的：通过同时测定不同程度关节软骨损伤患者膝关节液中Ⅱ型胶原羧基端端肽(C-telopeptide of CⅡ,CTX-Ⅱ)与Ⅱ型前胶原羧基端前肽(Procollagen Ⅱ C-propeptide,PⅡ CP)的含量,通过观察二者之间的相互关系,一方面描述关节软骨损伤过程中的变化规律；另一方面研究二者在诊断关节软骨损伤中的作用。方法：收集2009-2011年在我院行关节镜诊治或关节置换术,并且抽取关节液的患者47例共48膝,男25例(25膝),女22例(23膝),对纳入病例行关节镜手术或全膝关节表面置换术时,取髌下外侧入路行膝关节腔穿刺抽取关节液,将关节液于取出后2小时内,4500rpm,20分钟条件下离心,留取上清液分装于Eppendorf管中,快速冷冻,在-80℃深低温保存待测。根据膝关节镜检查或全膝关节表面置换术时所见,采用Outerbridge软骨损伤评分法对髌骨面、股骨髌面、股骨内侧髁、股骨外侧髁、胫骨内侧髁和胫骨外侧髁共6个区域的关节软骨损伤情况进行评分。按Outerbridge软骨损伤评分最高评分将样本分为0分、1分、2分、3分、4分5个组,按Outerbridge软骨损伤累计评分将样本分为<10分组和≥10分组两组,按性别将样本分为男性和女性两组。采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)对关节液CTX-Ⅱ(武汉中美科技,E90686Hu)与PⅡCP(武汉中美科技,E90964Hu)浓度进行测定。结果：关节液中CTX-Ⅱ和PⅡCP含量无论是作为单独指标还是二者之间的比值,在不同关节软骨损伤程度间的差异都不具有统计学意义(P>0.05),而且与软骨损伤程度无相关性(P>0.05)；但是从数据分布来看,二者相对于软骨损伤评分有明显的下降趋势。而且关节液中CTX-Ⅱ浓度和PIICP浓度具有正相关(P<0.05)。结论：关节液中CTX-Ⅱ和PIICP的浓度无论作为独立指标,还是二者间比值,与软骨损伤程度间无明显相关关系；另外,总体上,CTX-Ⅱ和PIICP含量变化具有相关性,但每一个体,CTX-Ⅱ和PIICP含量变化并不一定同步。总之,CTX-Ⅱ和PIICP在描述骨关节炎病理生理过程具有一定的作用,但由于个体差异的影响,它们并不能作为标记软骨损伤程度的Marker。第四部分SELDI-TOF-MS技术在骨关节炎早期诊断中的应用目的：利用SELDI-TOF-MS技术寻找关节液中不同关节软骨损伤条件下的差异位点,建立早期诊断关节软骨损伤的诊断模型。方法：收集2009年在我院行关节镜治疗患者44例,其中男性24例,女性20例。关节镜下评定软骨损伤程度,应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术结合弱阳离子芯片,寻找关节液中不同软骨损伤情况下的差异位点。结果：软骨无损伤与软骨轻度损伤差异位点10个；软骨无损伤与软骨中度损伤差异第三部分关节液Ihh含量变化与关节软骨损伤的关系目的：结合关节镜下软骨损伤评分,测定关节液中的印度刺猬蛋白(Ihh)含量,研究Ihh含量与软骨损伤之间的关系,早期诊断关节软骨损伤。方法：收集2010年67例在我院行关节镜手术患者,其中男32例(32膝),女35例(35膝)。关节镜手术时,行膝关节腔穿刺抽取关节液,将关节液于抽出后2小时内,以4500rpm,20分钟条件下离心,留取上清液分装于Eppendorf管中,快速冷冻,在-80℃深低温保存待测。根据膝关节镜检查,采用Outerbridge软骨损伤评分法对膝关节内6个区域的关节软骨损伤情况进行评分。按Outerbridge软骨损伤评分最高评分将样本分为0分、1分、2分、3分、4分5个组。采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)对关节液中ihh含量进行测定(武汉中美科技)。结果：在软骨损伤最高评分2分以内,Ihh含量成增高趋势,2分以外呈下降趋势；两组间对比分析,0分与2分、0分与3分之间有显著差异,p值分别是1.237E-05和1.237E-05；1分与2分、2分与4分之间有显著差异,p值分别是0.0250153和0.0017442。其它评分之间对比无显著差异。结论：虽然Ihh含量在软骨无损伤和软骨极轻度损伤(Outerbridge评分=1)之间无明显差异,但是Ihh含量在软骨无损伤和软骨轻度损伤(Outerbridge评分=2)之间有显著差异。这样对于临床无症状或轻微,影像学检查没有表现的软骨损伤较早期患者具有十分重要的意义。Ihh含量升高提示关节软骨损伤损伤。位点30个；软骨轻度损伤与软骨中度损伤差异位点17个。每个差异位点蛋白相对含量都以均数±标准差表示,所有的标准差相对均数均较大,未发现特异性高的蛋白或多肽。结论：运用SELDI-TOF-MS技术结合弱阳离子芯片研究关节液蛋白质组学,是一种快捷有效的关节液差异蛋白筛选方法,操作简单,高通量,重现性好。本实验未发现在软骨损伤早、中期产生特异性高的蛋白质或多肽；但是提示我们关节软骨在损伤初期(Outerbridge评分<4),关节软骨代谢以合成代谢升高为主,而随着软骨损伤进一步发展,软骨降解代谢迅速加强,这也许说明软骨损伤可以在很早阶段(Outerbridge评分>6)发生不可逆改变。虽然发现了多个差异蛋白位点,但由于所有的差异点特异性都很不高,不能有效形成特异性节点,无法建立早期诊断模型。第五部分滑膜炎与关节软骨损伤程度间的关系目的：研究不同关节软骨损伤情况下关节滑膜的表现,并用其来分析二型胶原羧基端端肽(C-telopeptide of Collagen Ⅱ,CTX-Ⅱ)和二型前胶原羧基端前肽(Procollagen Ⅱ C-propeptide,PⅡ CP)含量的数值分布情况,探讨滑膜炎对测定结果的影响。方法：收集2001年至20008年关节镜手术337例,共339膝,其中男性161例,女性176例；年龄范围11～82岁,平均42.9岁。采用Outerbridge评分标准分别对髌骨面、股骨髌面、股骨内侧髁、股骨外侧髁、胫骨内侧髁、和胫骨外侧髁共6个区域的关节软骨损伤病理变化情况进行评分,并将评分累加。对滑膜采用Ayral评分法,对膝关节滑膜9个区域进行评分,按公式计算出滑膜炎评分。统计分析二者之间的关系。结果：软骨损伤评分和滑膜炎评分做Spearman相关分析,结果表明软骨损伤评分与滑膜炎评分呈正相关(r=0.690,p<0.001)。当软骨损伤评分为零分时,将年龄和滑膜评分作Spearman相关分析,结果表明年龄与滑膜炎评分呈正相关(r=0.353,p<0.001)；性别与滑膜炎两者之间spearman相关系数为0.020,p值为0.827,提示两者之间无相关性。结论：随着软骨损伤程度逐步加重,滑膜炎程度亦同时加重；然而,随着滑膜炎程度逐步加重,软骨损伤程度并不一定加重(出现最严重滑膜炎时,软骨也不一定有损伤)；并且,年龄因素对滑膜炎程度起重要作用。由此可以得出,软骨损伤对滑膜炎起决定作用,但同时,滑膜炎受多种因素影响,滑膜炎并不具备提示软骨损伤,并且加重骨关节炎的作用。