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气孔是植物表皮由两个保卫细胞围绕形成的小孔,在调节植物光合固碳和水分散失的平衡方面影响颇大。气孔的发生是一种复杂的生物学过程,受多种基因所调控。气孔的发育不但可以影响植物的生长,也关系到植物应对环境胁迫的能力。目前,已有一些报道发现miRNA可以参与到气孔的发生过程,但其分子作用机制仍然不是很清晰。本研究旨在初步阐明大青杨miR172调控气孔发育响应干旱胁迫的分子机理。利用生物化学、分子生物学和基因工程等手段对大青杨Pu-miR172d及其靶基因PuGTL1的分子功能进行了分析鉴定。(1)小RNA转录组数据中靶基因预测结果发现Trihelix基因家族成员PuGTL1是Pu-miR172d的靶基因。利用5’RLM-RACE技术及农杆菌瞬时转化实验验证了 PuGTL1确实为Pu-miR172d的靶基因。首次在大青杨中发现了Pu-miR 72可以结合Trihelix家族的转录因子;(2)利用生物信息学方法和qRT-PCR技术对毛果杨Trihelix转录因子家族进行初步的分类及功能鉴定。Trihelix家族由56个成员构成,可分为五个亚族。其中,大多数基因都可以响应渗透胁迫。exImage分析结果表明PuGTL1主要在幼叶中表达。QRT-PCR结果显示PuGTL1下调表达在一定程度上可以提高植物抗逆性;(3)QRT-PCR结果显示Pu-miRI72d在第1-4片幼叶中表达量较高,并且其可以响应渗透胁迫。克隆大青杨Pu-miR172d启动子序列,构建Pu-miR172dpro::GUS表达载体。GUS染色后发现Pu-miR172d主要在叶片气孔中表达,暗示着Pu-miR172d可能参与早期的气孔运动或发育;(4)克隆全长大青杨Pu-miR172d序列,构建Pu-miR172d过表达和抑制表达载体。组培苗PEG6000渗透胁迫后发现,Pu-miR172d过表达转基因大青杨与WT相比,长势良好且生根率较高,而Pu-miR172d抑制表达转基因大青杨与WT差别不大。DAB、NBT和Evans bule组织化学染色及SOD、POD、MDA、电导率和叶绿素含量等生理指标测定结果显示Pu-miR172d过表达植株的抗逆性较强,说明Pu-miR172d具有一定的抗渗透胁迫能力;(5)Pu-miR172d过表达大青杨植株变矮,气孔密度显著减少,且净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均低于WT,而瞬时水分利用率高于WT。Pu-miR172d过表达植株在干旱胁迫下叶片含水量更高,且干旱复水后,Pu-miR172d过表达植株可继续正常生长,而WT和Pu-miR172d抑制表达植株生长受到严重抑制。首次发现了 Pu-miR172d可以影响气孔发育,其可以通过减少气孔密度,降低蒸腾速率,提高瞬时水分利用率,从而提高植物的抗旱能力;(6)WT和Pu-miR172d过表达大青杨干旱处理前后的转录组数据中,有大量的与光合作用、失水胁迫和渗透胁迫响应的差异基因。干旱胁迫后,Pu-miR172d又促进了一些抗旱基因表达。QRT-PCR结果显示,PuGTL1在Pu-miR172d过表达植株中的转录水平明显下降,进一步说明了PuGTL 是Pu-miR72d的靶基因。但PuGTL1具有组织表达特异性,只在自上而下的第1-5片叶差异表达;(7)大青杨PuGTL1-SRDX抑制表达转基因大青杨土培苗与Pu-miR172d过表达植株在表型观察和生理指标测定结果方面基本一致,PuGTL的抑制表达也可使气孔密度减少来降低蒸腾速率,并且提高瞬时水分利用率,使植物具有更强的抗旱性。QRT-PCR显示PuG7L1的靶基因PuSDD1在PuGTL1-SRDX抑制表达植株和Pu-miR172d过表达植株中均显著上调。综合以上实验结果,说明Pu-miR172d可以抑制PuGTL1进而诱导PuSDD1上调表达来减少气孔密度、降低蒸腾速率、提高水分利用率,从而增强植物的耐旱性,阐明了大青杨Pu-miR172d通过抑制其靶基因PuGTL1的表达来调控植物气孔发育的分子机理。这将为今后研究林木miRNA调节气孔发育及抗旱育种奠定一定的理论基础。