食源性致病菌中毒会导致多种疾病,威胁人民生命健康,造成严重的经济风险。食品、动物、饮用水,甚至用于加工和运输食品和水的设备都是食源性致病菌的宿主。大多食源性致病菌可以在几个小时内迅速增殖到致病水平,而现有的食源性致病菌商业检测方法存在特异性差,费时费力,对操作人员的专业度要求高等各种劣势。因此,在致病菌感染初期对其进行及时检测,推进更加灵敏而迅速的食源性致病菌检测方法的开发至关重要。碳量子点（CD）作为一种荧光信号分子,由于制备简单、荧光性能佳、生物毒性低、生物相容性好等优点,已经在许多领域逐步取代传统的荧光染料。核酸适配体由于其比抗体更宽松的使用条件和储运要求正在逐步替代抗体作为分子识别物质应用于检测领域中,但在浓度过高时可能会相互纠缠,影响对靶标的识别效率。通过碱基互补配对原则设计自组装形成的DNA四面体（Td）是相对简单的一种DNA三维结构,可进行自由编辑的Td结构拥有四个顶点,既能够偶联单链的核酸适配体识别靶标,又能偶联碳点,从而实现对荧光信号的放大。本研究的目的是利用CD和Td的偶联结构,在现有的磁分离夹心检测基础上设计构建两种信号放大方式,进一步提高检测灵敏度,实现对食源性致病菌的灵敏检测,并应用于实际食物样品中食源性致病菌的检测,以及对分析方法的选择性、灵敏度和准确性进行评价。本研究制备了多种CD,构建了稳固的Td结构,并设计了两种信号放大方式,主要研究结果如下:1.N-CD的制备及表征为了探究不同前体物质和反应条件对氮掺杂CD（N-CD）的影响以及获得表面含有大量羧基的N-CD,实验制备了以水、乙醇和二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂的三种N-CD,以不同比例水和乙醇作为溶剂的五种N-CD,不同酸碱度（p H=2,7,12）的三种N-CD、不同制备温度（120℃,160℃,200℃）的三种N-CD,不同制备时长（4h,6h,8h,10h）的四种N-CD以及不同前体物质（β-环糊精、对苯二胺（PPDA））、柠檬酸与尿素或乙酸铵)的四种N-CD,通过原子力显微镜（AFM）、傅里叶近红外光谱（FT-IR）、荧光分光光度检测和紫外光谱扫描对其形态特征、结构功能和荧光特性的差异进行表征对比,分析N-CD的发光特性。实验结果显示,溶剂极性与表面基团的形成相关,极性大的乙醇溶剂制备N-CD过程中,表面更容易生成与氧相关的基团,导致其荧光波长红移;p H升高促进N-CD之间的聚集,增大N-CD的粒径,p H为12的N-CD粒径最大,但不同p H的三种N-CD并没有显示依赖尺寸的荧光特性;200℃制备的N-CD荧光强度低于160℃,这是由于过高的制备温度使N-CD表面的非辐射陷阱造成了强烈的热猝灭;N源的引入会极大提高N-CD的荧光性能,少量的尿素比大量的乙酸铵赋予N-CD更加强烈的荧光,说明N源对N-CD荧光性能的不是靠其在前体物质中的含量变化而变化的。另外,对β-环糊精,PPDA,柠檬酸和尿素或者乙酸胺N-CD的细胞毒性试验显示,在共培养四天后细胞仍有高于95%的存活率,即这四种N-CD均具有较高的生物安全性。因此,以尿素为N源对C源进行掺杂,在不低于120℃和4h的条件下制备即可得到具有较高产率的荧光N-CD,并且可以通过溶剂对其发射光进行调整,这为将来无毒N-CD在食源性致病菌检测中的研究奠定了理论基础。2.Td的设计制备及优化设计了多个Td,通过Nupack对其在不同制备条件和离子浓度中可能形成的结构进行预测,筛选出理论产率最高的四种序列组合进行自组装,利用凝胶电泳验证Td的合成,之后通过对合成方式、缓冲溶液等条件的优化,得到产率最高,结构最稳定的Td。通过优化设计和合成方式,筛选出缓冲液中含有5m M Tris-HCl,2.5m M Mg2+,5m M Na+,使用优先合成T9T11T12,再与T10孵育的合成方式进行制备,得到产率高达89.58%的Td结构。AFM和凝胶电泳实验验证了Td结构的成功设计构建,该结构可以克服单链核酸适配体在基底表面的无序固定、相互缠绕及空间位阻,提高核酸适配体的识别效率。3.基于单个CD和Td制备的Td-CD单体荧光生物传感器夹心检测金黄色葡萄球菌及时检测金黄色葡萄球菌（St.aureus）至关重要,基于第一部分不同条件合成的N-CD的研究结果制备b CD,并将其与第二部分优化筛选得到的Td结构结合,制备了一种简单、灵敏的荧光信号放大器单体,结合磁分离进行对St.aureus的灵敏检测。将b CD修饰在Td的三个顶点,利用Td上的核酸适配体准确识别并将放大器“吸附”到St.aureus的表面。Td每个面上稳定的三角形结构不仅能将核酸适配体固定住,还能使核酸适配体之间彼此保持距离,防止它们过于靠近。AFM验证了这种信号放大器的成功制备。这种具有刚性底座的识别探针更易捕获靶标,是理想的致病微生物识别元件。细胞毒性实验结果显示,在细胞培养液中加入该荧光探针四天后,细胞存活率略有上升,说明该探针具有很高的生物安全性。使用该探针成功将靶标的荧光信号强度放大了4.72倍。该检测方法具有较强的荧光强度变化、灵敏度(线性范围为7.22×10~0-1.44×10~9CFU·m L-1,检测限为4CFU·m L-1)和特异性。该方法在肉汤、巴氏灭菌奶和饮用水样品中的回收率为96.54%-104.72%。与简单的核酸适配体夹心检测相比,荧光信号放大器单体提高了对靶标的荧光检测灵敏度。此外,这种荧光信号放大策略未来可能应用于其它食品病原或者环境微生物的检测。4.基于多个CD和Td制备的Td-CD荧光微球放大信号构建荧光生物传感器夹心检测鼠伤寒沙门氏菌制备了具有高荧光量子产率的CD421,在其表面修饰链霉亲和素（SA）,基于上个实验中构建的荧光信号放大器单体,将多个Td和CD421通过SA生物素之间的特异性结合进行组装,得到大小均匀,分散性良好的Td-CD421荧光微球,进一步放大靶标的检测信号,结合磁分离进行对鼠伤寒沙门氏菌（Sa.Typhimurium）的灵敏检测。这些以Td为骨架的荧光微球能够主动识别Sa.Typhimurium,并与靶标敏感结合后发出荧光,细胞毒性实验结果显示,实验构建的荧光微球加入细胞培养液后四天时间内,细胞存活率始终保持在85%以上,说明其具有较高的生物安全性。另外,该荧光微球成功将靶标的荧光信号强度放大了3.05倍,该方案成功实现了对10-1.0×10~8CFU·m L-1浓度范围内的Sa.Typhimurium的线性检测,检测灵敏度达到9CFU·m L-1。在真实巴氏杀菌牛奶和饮用水样品中进行加标回收实验发现,该方法的回收率为95.35%-103.01%。此外,该荧光信号放大策略为分析各种食品威胁因素和其他荧光成像应用提供了新的见解。