论文部分内容阅读
目的：探讨当归补血汤抗肝纤维化作用的配伍比例药效作用特点；基于组织缺氧及脂质过氧化损伤探讨较佳配伍比例的当归补血汤抗肝纤维化作用机制。为临床抗肝纤维化合理使用益气活血治法诠释部分理论依据。
方法：
1.Wistar雄性大鼠,随机分为正常组(8只),模型对照组(12只),芪归5:1方组(12只),芪归1:1方组(12只),芪归1:5方组(12只);另设N-乙酰半胱氨酸对照组(NAC)12只。采用CCl4复合因素造模方法,采用剂量首次100％CCl4溶液5ml/kg皮下注射,其后40％CCl4-橄榄油溶液3ml/kg皮下注射,每周2次,共6w。第1-2w给予高脂低蛋白饲料(79.5％玉米粉、20％猪油、0.5％胆固醇),而后给予纯玉米饲料。自由饮水。正常组给予普通饮食。自造模之日起,当归补血汤各用药组均以6g/kg,N-乙酰半胱氨酸以0.1g/kg的大鼠体重剂量用药灌胃(相当于60kg等体重成人剂量的10倍量),每日1次,共6w。正常组和模型对照组灌胃以等量生理盐水。于造模6w结束后处死全部大鼠。
2.透射电镜观察肝组织超微病理和胶原纤维；HE染色和天狼星红染色分别观察大鼠肝脏炎症及胶原沉积的病理改变。
3.试剂盒法观察大鼠血清肝功能(ALT、AST、总胆红素、白蛋白)、脂质过氧化指标(SOD、MDA、GST)变化。
4.Jamall氏盐酸水解法检测大鼠肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量变化。
5.免疫组化染色观察I型胶原、α-SMA、HIF-1α蛋白的表达。
6.Western印记法分析大鼠肝组织Col-I、Col-IV、α-SMA、TIMP-1、TIMP-2、MMP-2、MMP-9、TGF-β1、ERK、p-ERK、HIF-1α蛋白表达的变化。
7.明胶酶图法和原位明胶酶图法分析大鼠肝组织MMP-2、MMP-9的活性变化。 8.Real time PCR观察的MMP-2、HIF-1αmRNA表达的变化。
结果：
1.与正常组比较,模型组肝组织炎症损害严重、胶原沉积明显、肝功能异常、肝组织脂质过氧化损伤严重；肝组织Hyp含量和I型胶原含量增多；明胶酶MMP-2、MMP-9及活性MMP-2明显增强。与模型组比较,芪归不同配伍的当归补血汤方组肝组织炎症病变轻微,胶原纤维明显减少；肝功能和肝脏组织脂质过氧化损伤明显改善,肝组织Hyp含量和I型胶原含量下降；基质金属酶MMP-2/9活性表达明显抑制,具有良好的抗肝纤维化作用,其中芪归比例为5:1经典当归补血汤(以下简称当归补血汤方组)组效果较其他组更佳。
2.与模型组比较,当归补血汤方明显改善受损的线粒体等超微结构,胶原纤维明显降低；抑制α-SMA和基质胶原IV胶原表达；抑制肝脏基质金属蛋白酶MMP-2/9蛋白活性表达,尤其是Active MMP-2表达；下调TIMP-1/2蛋白的表达,促进ECM降解。
3.当归补血汤方有效抑制MARK途径p-ERK1/ERK2对HIF-1α蛋白的调节,下调其靶基因TGF-β1、MMP-2表达,显著改善肝组织缺氧,阻止肝纤维化进展。
结论：
1.不同芪归比例(5:1,1:1,1:5)的当归补血汤均具有抗肝纤维化作用,其中芪归比例为5:1经典比例的当归补血汤作用较佳。
2.改善肝组织缺氧及脂质过氧化损伤,维护肝组织微环境是当归补血汤抗肝纤维化的重要作用机制。
3.“正气虚损”是肝纤维化的重要发病原因,益气中药在预防肝纤维化中有重要作用,其机制与改善组织缺氧及脂质过氧化损伤有关。