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侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)是由曲霉属感染所致,其中以烟曲霉感染最为常见,其次为黄曲霉、黑曲霉等。近年来,侵袭性曲霉病的患病率呈现上升趋势,病死率居高不下,且不断有曲霉对抗真菌药物耐药的报道。然而,曲霉体外药物敏感性检测在各个医院并未常规开展。曲霉体外药物敏感性试验方法尚不统一,包括稀释法、纸片扩散法、E-test法等,其中稀释法具有准确度高、重复性好的特点。目前,稀释法检测曲霉体外敏感性的方法主要有两种,分别是欧洲抗菌药物敏感试验委员会(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)发布的方法和美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)发布的方法。唑类抗真菌药物对曲霉的作用部位在细胞膜,通过抑制14-α-去甲基酶(cyp51酶)而使得曲霉细胞膜中羊毛甾醇到麦角固醇的生物合成受阻,从而抑制曲霉生长。经研究证实,烟曲霉对唑类抗真菌药物耐药性的产生,大多由于cyp51A基因的突变,包括54、220等位点突变引起的获得性耐药机制和TR/L98H突变引起的天然耐药机制。目前,南京地区尚缺乏曲霉临床分离株的体外药物敏感性相关数据。故而本研究通过收集南京地区曲霉临床分离株,检测其对抗真菌药物的体外药物敏感性,并对耐药烟曲霉株的耐药机制进行初步探讨。研究一:南京地区曲霉临床株体外药物敏感性调查目的:调查南京地区曲霉临床株对抗真菌药物的体外药物敏感性,并比较EUCAST和CLSI微量稀释法检测曲霉体外药物敏感性的差异。材料与方法:收集南京地区5家大型教学医院2012～2013年的曲霉临床分离株,经菌落形态、镜下特征及分子生物学鉴定后,10%甘油-80℃冰冻保存。分别采用EUCAST和CLSI微量稀释法检测所收集曲霉株对两性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑、卡泊芬净和米卡芬净的体外药物敏感性,比较两方法的基本符合率、药敏符合率、重大误差率和极重大误差率。结果:共收集临床曲霉分离株116株,包括烟曲霉81株、黄曲霉28株和黑曲霉7株。EUCAST和CLSI两方法均检测到3株烟曲霉对伊曲康唑的最小抑菌浓度(MIC)≥4μg/mL,对116株曲霉药敏检测的基本符合率为96.3%～100%。两方法检测烟曲霉对伏立康唑的药敏符合率为98.8%,重大误差为1.2%,极重大误差率为0;烟曲霉和黑曲霉对两性霉素B以及烟曲霉和黄曲霉对伊曲康唑的药敏符合率均为100%,重大误差率和极重大误差率均为0。结论:南京地区存在唑类抗真菌药物耐药烟曲霉株,对伊曲康唑耐药比例为3.7%;未发现有对两性霉素B耐药的曲霉株;所检测曲霉株对卡泊芬净和米卡芬净均具有较低的最低有效浓度。EUCAST和CLSI微量稀释法对曲霉体外药物敏感性具有良好的一致性。研究二:烟曲霉对伊曲康唑的耐药机制研究目的:研究伊曲康唑耐药烟曲霉株的cyp51A基因突变情况。材料与方法:回顾分析伊曲康唑耐药烟曲霉株感染患者的临床资料。提取并扩增伊曲康唑耐药烟曲霉株的cyp51A基因,ABI 3730XLDNA基因测序,同GenBank AF.338659烟曲霉cyp51A基因标准序列比对,以明确其突变情况。结果:三例伊曲康唑耐药烟曲霉株感染患者均死亡。其中,一例侵袭性曲霉病患者发病前给予伊曲康唑以预防真菌感染,其cyp51A基因存在M220I突变;另外两例患者侵袭性曲霉病发病前未给予抗真菌药物预防治疗,其cyp51A基因存在TR/L98H 突变。结论:南京地区伊曲康唑耐药烟曲霉株的耐药产生机制,既有天然耐药,又有获得性耐药。耐药烟曲霉株感染患者预后不良。