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芋螺毒素(Conotoxins,CTX)具有序列超变、二硫键丰富、结构新颖、靶点广泛、生物毒性强等特点。它们既可以作为生物体内具有重要生理功能靶点的探针和“解码器”,又可作为海洋新药及新药的先导化合物来研究与开发。目前随着海南产芋螺资源日益濒危,尽快抢占药用海洋生物芋螺的基因资源制高点,具有非常重要的战略意义。深入研究芋螺毒素的生物合成法在海洋生物医药领域既有重要的理论价值,又具有广阔的应用前景和巨大的潜在经济效益。人工化学合成芋螺毒素成本高、毒性大、氧化折叠后的异构体产物异常复杂,难以纯化且产率很低。通过基因工程方法获得廉价重组芋螺毒素,可望解决芋螺毒素天然资源匮乏、分离纯化困难、化学合成昂贵等难题。为此我们根据芋螺毒素基因设计了多条合成引物,分别克隆到四种不同表达系统的表达载体中,探索芋螺毒素基因在四种表达系统中的表达效果,为芋螺毒素的结构和功能研究奠定基础。本研究主要包括以下几个部分：1.芋螺毒素基因GeXIVAWT在大肠杆菌中的表达根据芋螺毒素基因GeXIVAWT按照大肠杆菌密码子偏好设计了GeXIVAWT-P1/2和GeXIVAWT-P3/4两对引物,退火后形成基因GeXIVAWT-12和GeXIVAWT-34,其中基因GeXIVAWT-12引入终止密码子表达后具有完整的C末端；基因GeXIVAWT-34未引入终止密码子表达后带有His-tag便于重组蛋白的纯化。它们分别与双酶切的表达载体pET22b(+)连接,成功构建了两个表达载体pGeXIVAWT-12和pGeXIVAWT-34.将这两个表达载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG进行诱导表达,结果重组芋螺毒素GeXIVAWT-12/34均以包涵体的形式获得了高效表达,经超滤管纯化的rGeXIVAWT-12和亲和柱纯化的rGeXIVAWT-34进一步RP-HPLC分析并质谱鉴定发现大肠杆菌信号肽未能有效切除,其中rGeXIVAWT-34经条件优化后的最大表达量为61.6mg/L。通过稀释法进行体外复性后获得具有生物活性的重组芋螺毒素,活性实验表明重组芋螺毒素能够抑制昆虫细胞Sf9的生长,并具有剂量效应。2.芋螺毒素基因MrVIB在大肠杆菌中的表达根据芋螺毒素基因MrVIB设计了未进行密码子优化的引物MrVIB-P1/2,退火后形成基因MrVIB-12,其未增加终止密码子表达后具有His-tag便于重组蛋白的纯化。它与酶切的表达载体pET22b(+)连接,成功构建了表达载体pMrVIB-12。将这个表达载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG诱导和表达条件优化,结果重组芋螺毒素MrVIB获得了分泌表达,经亲和层析纯化和进一步RP-HPLC分析后质谱鉴定结果表明信号肽被大肠杆菌内源性的信号肽酶成功地切除,且在细胞周质中形成正确的三个二硫键。动物实验模型表明重组芋螺毒素MrVIB比非选择性镇痛药具有很强的缓解小鼠疼痛的药理学作用。3.芋螺毒素基因MrVIB在毕赤酵母中的表达根据芋螺毒素基因MrVIB设计了4对引物分别为MrVIB-P5/6.MrVIB-P7/8、 MrVIB-P9/10和MrVIB-P11/12,其中MrVIB-P9/10和MrVIB-P11/12两对引物按照毕赤酵母偏爱密码子进行优化。四对引物分别退火后形成基因为MrVIB-56、 MrVIB-78、MrVIB-910和MrVIB-1112,其中基因MrVIB-56和MrVIB-910未引入终止密码子表达后带有His-tag便于后期目的蛋白的纯化；基因MrVIB-78和MrVIB-1112引入终止密码子表达后具有完整的C末端。它们分别与双酶切的毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,成功地构建了四个酵母表达载体分别为αA-MrVIB-56、αA-MrVIB-78、αA-MrVIB-910和αA-MrVIB-1112。将构建好的表达载体线性化后电转化毕赤酵母菌GS115,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后获得了高拷贝酵母重组子,并利用甲醇进行了诱导表达研究。初步探索了诱导表达的条件,结果表明选择培养基MGY/MM比BMGY/BMMY诱导表达效果好。表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,结果表明带组氨酸标签的重组芋螺毒素MrVIB-56和MrVIB-910获得了表达,且优化密码子的重组芋螺毒素MrVIB-910的表达量略有提高。由此可知,芋螺毒素基因MrVIB已在毕赤酵母中获得成功表达,但表达量很低,有待于进一步的优化表达条件并进行分离纯化后质谱鉴定和生物活性研究。4.芋螺毒素基因MrVIB在昆虫细胞中的表达根据芋螺毒素基因MrVIB序列,设计了两条引物MrVIB-P13/14,退火后形成基因MrVIB-1314,并引入终止密码子,表达的重组芋螺毒素可获得完整的C末端。将引物退火后获得基因,连接到载体pFastBacTMTB上,成功构建了重组载体pFastBac-MrVIB-1314.然后将这个表达载体转化DH1OBac感受态大肠杆菌,通过辅助质粒Hlper帮助将基因MrVIB整合到穿梭载体Bacmid中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-MrVIB-1314。通过脂质体介导方法将重组杆状病毒载体Bacmid-MrVIB-1314转染昆虫细胞Sf9,使杆状病毒载体在昆虫细胞内复制并表达重组芋螺毒素。表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,结果表明杆状病毒Bacmid-MrVIB-1314在感染的昆虫细胞中获得了表达,具体的验证还需要进一步进行分离纯化后质谱鉴定及生物活性研究。5.芋螺毒素基因MrVIB在哺乳动物细胞中的表达根据芋螺毒素基因MrVIB设计引物两对引物MrVIB-P17/18和MrVIB-P19/20,退火后分别形成基因MrVIB-1718和MrVIB-1920。它们分别与双酶切的表达载体pcDNATM4/Max-HisA和pcDNATM3.1/V5-HisA连接,成功地构建了两个重组表达载体pcDNA4-MrVIB-1718和pcDNA3.1-MrVIB-1920。利用脂质体介导法将这两个重组表达载体转染CHO细胞,经过抗生素G418筛选得到具有遗传稳定性的细胞CHO-1718和CHO-1920,能够稳定表达重组芋螺毒素。表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,结果表明重组芋螺毒素MrVIB-1718和MrVIB-1920在CHO细胞中以分泌的方式进行表达,有利于表达后的翻译修饰,可形成天然芋螺毒素的结构与生物活性。具体的验证还需要进一步进行分离纯化后质谱鉴定及生物活性研究。综上所述,芋螺毒素基因分别在目前常用的大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒和哺乳动物细胞等四种表达系统中获得表达,为探索和建立高活性、低成本、安全性高的大规模生产重组芋螺毒素的外源表达系统奠定了基础。