【摘 要】
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丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科鼠尾草属植物,其干燥根和根茎入药,具有活血调经、祛瘀止痛、养心除烦等功效。丹参的主要活性成分丹参酮属于二萜类化合物,具有良好的保护心脑血管作用和抗肿瘤作用。然而目前市场的丹参面临野生品种供不应求、栽培品种品质下降的问题,故探究丹参酮生物合成的调控机制,从而通过生物技术手段提高栽培丹参的品质,对丹参的临床应用具有重要意义。ERF（et
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丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科鼠尾草属植物,其干燥根和根茎入药,具有活血调经、祛瘀止痛、养心除烦等功效。丹参的主要活性成分丹参酮属于二萜类化合物,具有良好的保护心脑血管作用和抗肿瘤作用。然而目前市场的丹参面临野生品种供不应求、栽培品种品质下降的问题,故探究丹参酮生物合成的调控机制,从而通过生物技术手段提高栽培丹参的品质,对丹参的临床应用具有重要意义。ERF（ethylene responsive factor）转录因子是AP2/ERF家族中的一个亚家族,大量研究表明ERF转录因子可调控多种植物体内次生代谢产物的生物合成。课题组前期研究发现丹参内生真菌深绿木霉Trichoderma atroviride D16制备的多糖提取物（Polysaccharide fraction,PSF）可高效提高丹参毛状根中的丹参酮含量,并促进毛状根的生长,但具体机制尚不明确。本研究对D16 PSF诱导的丹参毛状根进行了转录组测序,筛选可能调控丹参酮生物合成的ERF转录因子,对转录因子进行生物信息学分析、表达特征分析、生物学功能验证和调控机制研究。本研究的主要研究结果如下:1、对D16 PSF诱导的丹参毛状根和对照组丹参毛状根进行转录组测序,发现有40条AP2/ERF家族转录因子的表达量被上调,通过与具有调控萜类合成功能的ERF转录因子进行多序列比对,筛选得到2条可能调控丹参酮生物合成的ERF转录因子SmERF1b和SmERF1-like。结构域分析显示SmERF1b和SmERF1-like蛋白均只含有一个AP2结构域;系统进化树显示SmERF1b和SmERF1-like与拟南芥、芝麻和丹参中的部分ERF转录因子具有较高同源性;亚细胞定位预测显示SmERF1b和SmERF1-like均为核定位蛋白。2、通过亚细胞定位实验、器官表达分析实验和D16 PSF诱导的时间表达分析实验探究SmERF1b和SmERF1-like的表达模式。利用烟草瞬时转化技术验证SmERF1b和SmERF1-like的亚细胞定位情况,结果与预测的情况一致,该2条转录因子均定位在细胞核中,而细胞核是转录因子发挥转录调控功能的场所;挖掘SmERF1b和SmERF1-like在丹参转录组数据中根、茎、叶的表达分布情况,并采用q RT-PCR进行验证,两种方法结果一致,均显示SmERF1b和SmERF1-like在根中表达量最高,在茎中表达量其次高,在叶中几乎不表达,而丹参根是丹参酮合成和积累的部位;采用q RT-PCR测定D16 PSF诱导丹参毛状根0 d、6 d和18 d的转录因子表达量,结果显示SmERF1b和SmERF1-like的表达量均随着D16 PSF的诱导时间而显著升高,这与前期研究中丹参酮含量和丹参酮生物合成途径酶基因的表达量随D16 PSF诱导而升高的趋势一致。以上研究均表明SmERF1b和SmERF1-like可能具有调控丹参酮生物合成的功能。3、分别构建SmERF1b和SmERF1-like敲除及过表达的丹参毛状根体系,进行丹参酮含量测定和表型观测。结果显示SmERF1b敲除后的丹参酮含量显著下降,过表达后毛状根颜色变红,而敲除或过表达后的生物量均无显著变化;SmERF1-like敲除后毛状根生长严重受阻,而过表达后生长则更加迅速,且毛状根颜色变红。以上结果显示SmERF1b可正向调控丹参酮的积累,而SmERF1-like可能促进丹参酮的产生且潜在参与丹参毛状根的生长发育。4、通过酵母单杂交实验在体内分别探究SmERF1b和SmERF1-like与丹参酮生物合成途径酶基因的结合情况,结果显示SmERF1b可与丹参酮生物合成途径Sm KSL1启动子的GCC-box结合,而SmERF1-like可同时与丹参酮生物合成途径酶基因Sm IDI1和Sm KSL1启动子的GCC-box结合;通过凝胶迁移率实验（EMSA）在体外分别探究SmERF1b和SmERF1-like与丹参酮生物合成途径酶基因的结合情况,实验结果与酵母单杂交结果一致。以上研究说明SmERF1b可以直接调控丹参酮生物合成途径的Sm KSL1,而SmERF1-like可同时与丹参酮生物合成途径的Sm IDI1和Sm KSL1直接结合。综上所述,丹参内生真菌深绿木霉D16的PSF诱导子通过促进丹参毛状根中转录因子SmERF1b和SmERF1-like的表达,调控丹参酮生物合成途径酶基因的表达,提高丹参酮的含量并促进毛状根的生长。本研究阐明了内生真菌D16诱导子PSF促进丹参酮合成的内在作用机制,填补了生物诱导子在调节植物次生代谢产物含量方面的研究,并为临床领域提高丹参酮产量提供了新的思路。
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