香鳞毛蕨是多年生药用真蕨类植物,在我国以黑龙江省为分布中心,特别是五大连池地区分布面积较大。由于其独特的生长环境和生长特点赋予了香鳞毛蕨独特的药用价值。香鳞毛蕨作为民间用药,主要用于治疗关节炎和各种皮肤病,包括银屑病、痤疮、皮疹和皮炎等,国内外学者研究发现,香鳞毛蕨还具有较强的驱虫、抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗病毒等多重作用。迄今为止,一些研究人员主要在形态解剖学观察、化学成分的提取分离及药理活性等方面对香鳞毛蕨进行研究,关于香鳞毛蕨中次生代谢途径相关酶基因的研究进行的较少。因此,模拟香鳞毛蕨特殊生境的温光处理对香鳞毛蕨有效成分的积累,并从分子角度阐明其调控机制,为实现我国野生香鳞毛蕨资源的有效保护和有效成分的可持续利用提供理论依据,应用前景十分广阔。在植物体中,包括木质素和黄酮类化合物等次级代谢产物都是由苯丙烷类代谢途径产生的,这些次级代谢产物不但对植物体自身具有重要的作用,而且对人体的健康具有重要作用,因此,苯丙烷代谢途径及途径中的关键酶成为人们研究的热点。在这条代谢途径中,4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)位于主途径向分支途径过渡的关键点上,控制进入不同的苯丙烷类化合物代谢支路,产生不同的次级代谢产物,并且研究发现4CL基因属基因家族形式,不同的4CL基因可控制代谢途径的不同方向,研究4CL基因家族成员对次级代谢产物调控及次级代谢物质的积累有重要意义,也为广泛研究及应用香鳞毛蕨的次级代谢产物打下坚实基础。本试验在前期的温光诱导香鳞毛蕨转录组的测序的研究中,确定苯丙烷类衍生物代谢途径是香鳞毛蕨黄酮类化合物的重要代谢途径,这与被子植物的苯丙烷类代谢较为相似。其中,4-香豆酸辅酶A连接酶基因则是这个代谢途径中的关键酶基因。目前,4CL基因在被子植物、裸子植物、苔藓植物已经被广泛的研究,而对于蕨类植物中则鲜有报道。本研究结合本课题组对香鳞毛蕨转录组测序结果的分析,从中筛选出4-香豆酸辅酶A连接酶基因,得到的主要试验结果如下:1.本研究通过从本组前期试验获得温光处理的香鳞毛蕨转录组文库中筛选并选定Unigene15437_All,Unigene18514_All,Unigene21777_All Unigene32945_All 4条基因,通过序列比对发现,4个基因与已知植物4CL基因具有高度同源性,并以此为核心片段,进行后续试验。2.本文中通过RACE技术,将获得的4个核心片段进行全长的序列扩增,获得4个全长基因,并将Unigene15437_All,Unigene18514_All,Unigene21777_All Unigene32945_All命名为Df4CL1、Df4CL2、Df4CL3、Df4CL4。进一步研究这四个基因,发现都具有两个功能保守域Box I(SSGTTGLPKGV)和Box II(GEICIRG)及底物结合区Sbd I和Sbd II,并与公开发表的其他植物中的4CL基因具有高度的一致性。这4个基因之间的一致性为66.00%,编码分别539、565、552和573个氨基酸,4个基因推测的氨基酸序列之间的一致性为56.59%。确定这4个基因为4-香豆酸辅酶A连接酶基因,并确定为一个基因家族。3.本文运用CHIPS、CUSP和Codon W在线程序对自主克隆的香鳞毛蕨4CL基因(Df4CL)序列进行分析,并与大肠杆菌、酵母菌、拟南芥、烟草等基因进行比较,对了解Df4CL基因密码子使用特性,为其选择合适的表达系统具有重要意义。研究发现,香鳞毛蕨4CL基因对ATGC选择没有偏向性,并且与小立碗藓的密码子使用偏好性相一致。在密码子使用频率上,Df4CL基因与拟南芥的差异小于与烟草、大肠杆菌、酵母的差异;基于4CL基因的密码子使用偏性的系统聚类分析表明,香鳞毛蕨与小立碗藓、拟南芥聚为一类,因此预示香鳞毛蕨4CL基因更适合在拟南芥中外源表达。4.通过在线软件等生物信息学方法和手段分析香鳞毛蕨4CL蛋白的情况,研究发现,香鳞毛蕨4CL的4个蛋白均属于两性蛋白质,DF4CL2蛋白无跨膜区,DF4CL1、DF4CL3和DF4CL4蛋白有两个跨膜区,4个蛋白均无信号肽,并预测了4CL蛋白的高级结构,为今后对该蛋白的结构、功能和可能的酶催化机制、与底物结合位点等相关研究提供重要理论基础。5.香鳞毛蕨Df4CLs基因组织表达与总黄酮和总木质素含量之间基本正相关,在基因表达量高的组织中总黄酮和总木质素含量也较高,这说明从香鳞毛蕨中扩增出来的基因Df4CLs参与总黄酮和总木质素含量的合成。6.香鳞毛蕨4CL基因的表达还能被温度激活。在低温(4℃)或者高温(35℃)条件下,4个基因都表现为先增大后减少的趋势,而香鳞毛蕨中黄酮类化合物含量和木质素含量变化趋势与之基本一致,但峰值点不相同,一般而言,黄酮类化合物和总木质素含量达到最高点的峰值要比基因滞后,温度除影响基因的表达量外,还可能影响物质合成中酶的活性,导致含量的变化。7.紫外线照射同样会影响4CL基因及黄酮含量和木质素含量。在紫外线照射下,基因Df4CL3和Df4CL4显著增加,尤其是Df4CL3。而黄酮类化合物增加显著,木质素增加平缓。一般而言,在紫外线照射下,保护植物体防止紫外线辐射的黄酮类物质会显著增加,这与我们得到的试验结果也相一致。8.本文成功构建了Df4CL2的原核表达体系表达出具有酶活性的重组蛋白,通过表达载体p ET28a-Df4CL2中的HIS标签成功纯化出重组蛋白。9.本文成功构建了植物表达载体pBI121-Df4CL1,通过浸花法对拟南芥野生型植株进行遗传转化。利用PCR方法对转基因植株进行检测,获得纯合体转基因植株,并对黄酮化合物和木质素含量进行检测,结果显示,转基因植株中的含量明显高于野生型。