前言儿童便秘为常见的临床症状,而不是一种独立的疾病。据Thowa大学和Heston大学医院儿科门诊统计,儿童便秘的发生率为3%—8%,其中90%—95%是功能性便秘。按照我国13亿人口统计,约有3亿儿童,其中有二千万左右的儿童患有便秘。便秘对儿童个体生长发育危害巨大,病因目前尚不清楚,治疗上存在泻药滥用问题;如何判定儿童便秘病因,并制订有针对性的措施进行治疗,正是本研究所要解决的问题。由于便秘在医学中地位及重要性的迅速提高,国内外相继对便秘及其病因等进行了众多的流行病学调查研究,尤其在成人便秘方面投入了大量的人力物力。迄今为止,国内己有北京、广东广州、成都、重庆、杭州、天津、上海、西安等地区对成人便秘及排便习惯进行了流行病学调查,国家更将老年人的便秘调查与多因素分析列为国家“九五”攻关项目(科研编号96-906-05-09),拨巨资支持。但是由于正常人群的排便习惯受饮食习惯、精神心理因素、环境和种族、文化背景等诸多因素的影响,儿童处于生理发育期,胃肠系统尚不成熟,因此儿童FC的患病情况相差较大,尤其是国内,此类研究相对少见,本研究从儿童最常见而且尚未解决的问题入手,首先对中国北方具有代表性的城市儿童进行大范围的流行病学调查,探讨北方儿童便秘的患病率,并在调查的基础上提出我国儿童便秘的诊断标准。功能性便秘是一个复杂的病理生理过程,其确切的发病机制目前尚不清楚,结直肠动力、盆底肌群的功能以及肠道菌群紊乱都可能与功能性便秘有关。在众多的研究中,结肠动力低下被认为是功能性便秘发生的重要因素之一,已有动物实验表明,内源性麻酚类物质可以抑制胃肠动力,主要是通过分布于神经末梢的受体CB1起作用。脂肪酰胺水解酶(Fatty acid amide hydrolase,FAAH)在体内能催化内源性麻酚类物质的水解,因此在理论上可以通过调节FAAH的活性来控制内源性麻酚类物质,以达到调节胃肠动力的目的。到目前为止,关于FAAH是否在人类的胃肠道中的作用还未见报道,因此本研究着眼于此,力图通过免疫组化、蛋白印迹和定量PCR技术从不同水平观察FAAH的表达情况,探讨其在便秘的发生过程中的作用。另外,随着分子生物学技术在微生物领域应用的不断进步和微生态学的不断完善,越来越多的肠道菌群被克隆和分离出来,细菌在胃肠道中的作用也逐步得到确认,人们对肠道菌群的认识已不仅仅停留在以往的消化和吸收方面,越来越多的作用被开发出来,研究显示,肠道菌群可以通过其代谢产物调节胃肠动力,尤其是短链脂肪酸,可以通过多种不同的机制影响胃肠动力功能,因此本研究应用PCR-SSCP和BOX-PCR技术对正常肠道菌群进行DNA指纹图谱分析,观察肠道菌群在正常和便秘儿童肠道中的分布比例关系并结合应用气相色谱技术观察细菌代谢产物短链脂肪酸在正常和便秘儿童肠道中的分布比例关系,探讨肠道菌群及其代谢产物短链脂肪酸在儿童功能性便秘发病中的作用。材料和方法一、流行病学调查应用分层、整群随机抽样方法对中国北方5市(包括北京、天津、沈阳、吉林和哈尔滨)常住儿童中2～14岁的儿童进行问卷调查,调查问卷由专门从事流行病学调查的专家协助设计,首先进行预调查,然后进行普查,共发放问卷20000份,其中北京6000份,天津4000份,沈阳4500份,哈尔滨3000份,长春2500份,根据普查结果了解按儿童罗马Ⅱ标准判断的FC的检出率,再对筛出的部分人在医院进行精查(结肠传输试验,钡灌肠及排便造影,消化道测压)以排除结肠器质性疾病,计算我国北方城市儿童儿童功能性便秘的患病率。详细记录与儿童功能性便秘有关的各种危险因素以及与排便有关的各种相关症状,对各种危险因素与儿童功能性便秘的关系进行逐步logistic回归分析,分析其对于儿童功能性便秘的贡献;按儿童罗马Ⅱ标准筛选确定便秘组,分析各相关症状在便秘组和非便秘组发生的频率,用卡方对单因素进行比较,再对有意义的症状用logistic回归模型作拟合优度检测,探讨儿童功能性便秘的危险因素,初步制定适合我国儿童的便秘标准。二、排便功能检测研究对象分为对照组和便秘组。对照组33例,平均年龄5岁;便秘组96例,平均年龄6.5岁,均符合儿童功能性便秘罗马Ⅱ诊断标准;联合应用结肠传输试验,X线排便造影和肛门直肠测压对对照组和便秘组儿童进行全面检查,分析其影像学及功能学表现的差异,探讨这些异常在儿童功能性便秘的病理生理及其对便秘的诊断和分型的意义;三、慢传输性便秘儿童结肠壁内FAAH的表达及意义研究对象分为便秘组和对照组,对照组16例,其中男10例,女6例,平均年龄7.5岁。便秘组男15例,女7例,平均年龄7岁,均符合STC的标准,分别取上述病例结肠标本,按部位分为升、降和乙状结肠,其中对照组升结肠5例,降结肠3例,乙状结肠8例;便秘组升结肠4例,降结肠18例,乙状结肠22例;应用免疫组化,Western blotting,Real Time PCR对便秘组和对照组儿童结肠壁内FAAH的表达分析,探讨FAAH在正常结肠壁内的定位和定量表达及其意义,并联合应用免疫荧光双重染色技术观察FAAH与CB1受体的位置与分布,探讨FAAH在生理条件下对结肠功能进行调控的作用机制;同时还进一步联合应用高压液相色谱技术对便秘组儿童结肠壁内FAAH的生物活性进行定量检测和分析,探讨其在儿童功能性便秘发病中的作用。四、功能性便秘儿童肠道菌群DNA指纹图谱的建立及意义研究对象分为对照组和便秘组,采用儿童功能性便秘罗马Ⅱ标准确立便秘组,便秘组15例,男9例,女6例,平均年龄6.5岁;对照组35例,男24例,女11例,平均年龄6岁。取对照组和便秘组所有儿童粪便标本进行分析。应用粪便细菌基因组DNA提取试剂盒提取粪便细菌基因组DNA,分别应用细菌16S rDNA的V3区引物和BOX基因组重复序列的引物BOX A1R进行扩增,然后进行电泳和图像分析,分别建立基于16SrDNA和BOX基因组重复序列的粪便细菌DNA指纹图谱,探讨PCR-SSCP和BOX-PCR对于粪便细菌的分离效果及其对粪便细菌菌种鉴定的意义;将扩增产物进行克隆测序,测序后对序列的同源性在GenBank数据库中使用BLAST工具进行比较,初步确定细菌的种属和分类,探讨肠道菌群在功能性便秘儿童的变化趋势及其对便秘产生的意义。五、功能性便秘儿童粪便短链脂肪酸的检测与分析应用气相色谱技术对便秘组和对照组儿童粪便中短链脂肪酸的含量进行定量检测,分析短链脂肪酸在功能性便秘儿童肠道内的变化趋势,进一步探讨肠道微生态菌落及其代谢产物短链脂肪酸在儿童功能性便秘发病中的意义。结果一、流行病学调查本次调查共发放问卷20000份,其中北京6000份,天津4000份,沈阳4500份,哈尔滨3000份,长春2500份。回收19638份,其中北京5452份,天津3788份,沈阳4066份,哈尔滨2713份,长春2267份,回收率98.19%;有效问卷19286份,有效率96.43%;有913名符合儿童罗马Ⅱ诊断标准,占被调查人数的4.73%;儿童FC的患病率具有地域差异性和年龄差异性特点,从地区上看,北京的患病率最高,为5.02%,长春最低,约4.27%,统计学差异显著(P＜0.001);从年龄上看,婴幼儿期(2-3岁)的患病率最高,学龄期(7-11岁)最低,统计学差异显著(P＜0.001)。性别分布无明显差异。逐步logistic回归证实人工喂养、添加辅食过早、饮食纤维低、挑食偏食、排便恐惧、抑郁、焦虑、体重、遗传、高经济收入及为FC的危险因素。对便秘的相关症状逐个进行单因素卡方分析比较,结果显示包括排便次数＜3次/周,大便干硬成团块状,排便费力,腹痛,恶心呕吐等在内的22种症状虽可在非FC人群中不同程度存在,但FC组发生频率比非FC组明显为高,统计学差异显著,多因素逐步logistic回归分析,结果显示排便次数＜3次/周,大便干硬成团块状,排便费力,需要泻药协助排便等症状在FC发生率更高,对诊断FC最有意义,减少的其他症状对FC诊断无影响,并以国际通用罗马Ⅱ标准为黄金标准,对拟定儿童FC症状学标准诊断试验的灵敏度,特异度和诊断准确率进行评价,结果显示,具备2条者的特异度和灵敏度均较适中,但诊断准确率最高。二、排便功能检测结肠传输时间测定结果显示,便秘组的TGITT、LCTT和RSTT较对照组明显延长,RCTT在两组无显著性差异。儿童FC结肠传输时间延长具有以下几种形式:①RCTT、LCTT和RSTT都延长;②单纯RSTT延长;③RCTT、LCTT和RSTT都延长,但RSTT延长更显著;④TGITT正常。X线排便造影显示耻骨直肠肌痉挛综合症14例:排便状态下直肠肛管角不开大,直肠后壁耻骨直肠肌压迹加深;肛门外括约肌痉挛4例:直肠肛管角正常开大,但会阴下降不明显,肛管前壁出现指状压迹;肠疝(包括小肠疝和结肠疝)3例:小肠或结肠下端疝入直肠膀胱陷凹,压迫直肠前壁;直肠粘膜脱垂和套叠3例:排便时肛管上方出现直肠粘膜影像;直肠前突2例:排便时直肠前壁向前方突出深度超过2cm;会阴下降综合症1例:盆膈摆动幅度大,下降时超过2cm;盆底痉挛综合症2例:表现为“鹅征”。肛门直肠测量结果显示,便秘组的肛管最大收缩压升高,对称指数明显降低而向量容积虽有增加,但不显著。三、慢传输性便秘儿童结肠壁内FAAH的表达及意义应用免疫组化,Western blotting,Real Time PCR对便秘组和对照组儿童结肠壁内FAAH的表达进行分析发现,正常结肠无论是升结肠、降结肠还是乙状结肠其壁内蛋白水平和mRNA水平均存在FAAH的表达,各段表达无显著差异,并且免疫染色显示FAAH主要定位于肠壁肌间神经元和粘膜的吸收细胞和肠腺体;在正常结肠,结合免疫荧光双重染色和共聚焦显微镜发现肌间神经元中FAAH的分布在位置上与CB1受体呈对应趋势,而在吸收细胞和肠腺体中未见此改变;在便秘儿童结肠,FAAH的表达显著减弱,结合高压液相色谱技术发现,FAAH的水解活性也显著降低,差异具有统计学意义。四、功能性便秘儿童肠道菌群DNA指纹图谱的建立及意义对照组和便秘组的所有样品分别进行3次以上的PCR-SSCP和BOX-PCR指纹图谱分析,得到了稳定可重复的图谱,无论便秘组还是对照组个体,图谱中均可见较多的电泳条带,从条带位置看,在对照组与便秘组,对照组之间以及便秘组之间既存在个体一致性条带,同时也存在个体特异性条带,且各条带亮度不鞠嗤?与PCR-SSCP图谱相比BOX-PCR图谱的泳带条数更多,各泳带之间界限清晰。测序结果显示,便秘组和对照组肠道内即存在相同的细菌菌种,也存在各自不一的菌种。在便秘组,菌种的种类较对照组明显增多,统计学差异显著;结合BOX-PCR指纹图谱的条带位置,对照组优势菌主要为拟杆菌属,埃希氏菌属,双歧杆菌属,乳杆菌属;便秘组的优势菌主要为脆弱拟杆菌属,埃希氏菌属,真杆菌属和梭菌属。五、功能性便秘儿童粪便短链脂肪酸的检测与分析气相色谱分析结果显示功能性便秘儿童粪便中每克干粪中短链脂肪酸含量较对照组减少,统计学差异显著,但便秘儿童粪便中含水量减少,短链脂肪酸显著升高,明显高于对照组,统计学差异显著,且各短链脂肪酸比例失调。结论(1)儿童FC是儿童期的常见病多发病,好发于2～3岁儿童;人工喂养、添加辅食过早、饮食纤维低、挑食偏食、排便恐惧、抑郁、焦虑、体重、遗传、高经济收入可能是FC的危险因素,应该对民众进行广泛的宣教做针对性预防和治疗。(2)我国儿童FC的症状学诊断标准为:①排便次数＜3次/周;②大便干硬成团块状;③排便费力;④需要泻药协助排便。具备上述的4个诊断标尺中2条者,症状持续至少2月即可诊断便秘。(3)儿童功能性便秘可以分为以下几种类型:①慢传输型便秘,近端结肠各节段传输功能异常。②出口梗阻型便秘:结肠出口处肛门直肠区域存在动力异常。③混合型便秘:同时存在结肠传输障碍和出口动力异常;联合应用结肠传输时间,X线排便造影和肛门直肠测压对儿童功能性便秘的病因诊断和临床分型具有重要意义。(4)人类正常结肠壁内无论是蛋白还是核酸水平均存在FAAH的表达,FAAH主要表达在结肠肌间神经丛的神经元内和肠粘膜表面的吸收细胞和腺体内,在肌间神经丛内FAAH的分布与CB1受体呈对应趋势。(5)慢传输性便秘儿童结肠壁内FAAH的表达减低,水解活性减弱,FAAH可能参与了慢传输性便秘的发生。(6)功能性便秘儿童肠道菌群的菌属多样性增加,肠道内存在与正常儿童相似的常驻菌,但优势菌种不同,各肠道菌属间存在比例失调。(7)功能性便秘儿童粪便中的短链脂肪酸含量减少,比例失调,功能性便秘的产生可能与肠道内短链脂肪酸吸收过度以及局部的短链脂肪酸浓度升高有关。