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乳杆菌与哺乳动物全身各部分黏膜共生,在口腔和消化道定殖的乳杆菌可抵御其他病原菌的侵害。防御素广泛存在于动物、植物和昆虫体内,是参与宿主机体抵御病原的第一道防线。近年来,大量研究表明乳杆菌能诱导人及其他动物防御素的产生。绵羊体内有2种p-防御素,即绵羊p-防御素-1(sheep beta defensin-1, SBD-1)和SBD-2,研究表明SBD-1在绵羊的呼吸道和整个消化道内有广泛的表达,而SBD-2只表达于舌和远端回肠,因此SBD-1可能是绵羊胃肠道先天免疫应答的重要组成部分。本试验首先建立了成熟稳定的绵羊瘤胃上皮细胞(rumen epithelia cells, RECs)体外培养体系,研究了乳杆菌对RECs作用后SBD-1的表达变化,接着对优势菌株植物乳杆菌诱导SBD-1表达的可能信号转导机制进行了初步研究,具体研究内容及结果如下：1.采取剪取瘤胃乳头法和瘤胃组织钝性分离法对瘤胃组织样本进行处理,分别用0.25%的胰蛋白酶消化进而获得RECs,结果发现瘤胃钝性分离后,酶消化能获得较为纯净单一的细胞；选择3种常用细胞培养基分别培养细胞,DMEM/F12培养基更利于RECs的生长；原代培养的RECs利用胰蛋白酶做差时消化进行纯化,纯化后的细胞经免疫细胞化学(immunocytochemistry、ICC)染色鉴定为阳性；绘制培养细胞的生长曲线,其生长规律符合细胞生物学特性。结果表明,成功建立了绵羊RECs的体外培养体系。2.选取2株乳杆菌,分别为干酪乳杆菌Zhang(Lactobacillus casei Zhang, L. casei Zhang)和植物乳杆菌P-8(Lactobacillus plantarum P-8, L. plantarum P-8),以不同的浓度分别刺激RECs 2 h,更换培养液后再继续诱导培养不同时间,实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)方法检测细胞中SBD-1 mRNA的表达量,结果表明乳杆菌与SBD-1 mRNA的表达具有时间、剂量依赖性,当浓度为107CFU/mL,诱导培养细胞8 h,可使SBD-1 mRNA的表达水平极显著高于对照组,并且L. plantarum P-8优于L. caise Zhang。3. 制备107 CFU/mL的L. plantarum P-8活菌菌液、热灭活菌菌液以及菌培养上清液分别诱导RECs 8 h, RT-qPCR和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测SBD-1的基因表达和蛋白分泌水平,结果表明L.plantarum P-8活菌和热灭活菌对SBD-1均具有诱导作用,但热灭活菌的诱导作用弱于活菌,菌培养上清液则不具诱导作用,结果表明乳杆菌可诱导RECs中SBD-1的差异性表达,且当107 CFU/mL的L. plantarum P-8刺激细胞并诱导培养8h时,SBD-1表达量最大。4.以107CFU/mL的L. plantarum P-8对RECs进行8h的诱导培养,采用RT-qPCR和蛋白质印迹法(Western Blot)检测Toll样受体2(Toll-like receptor 2, TLR2)和髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)的表达,结果发现TLR2和MyD88的基因水平和蛋白水平均显著高于对照组；阻断TLR2后,L. plantarum P-8对SBD-1的诱导作用减弱,说明TLR2参与细胞识别L. plantarum P-8并传递信号的过程。5.以107 CFU/mL的L. plantarum P-8对RECs进行8h的诱导培养,RT-qPCR检测到核因子κB1 (nuclear factor kappa B1, NF-κB1)和NF-κB2的基因转录水平均显著高于对照组,Western Blot方法检测到NF-κB的抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB a,IκBα)的磷酸化水平升高；NF-κB的特异性抑制剂(PDTC)可抑制L. plantarum P-8对SBD-1的诱导作用,提示NF-κB信号通路参与了L. plantarum P-8对SBD-1诱导表达。6.以107 CFU/mL的L. plantarum P-8对RECs进行8h的诱导培养,通过RT-qPCR和Western Blot方法,证实细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38)基因的表达水平显著升高,并且ERK1/2和p38蛋白的磷酸化水平也显著高于对照组；之后分别用ERK1/2和p38的信号通路抑制剂(PD98059和SB202190)预处理细胞后再进行诱导培养,结果显示L. plantarum P-8几乎不能诱导细胞内SBD-1的表达,结果表明L. plantarum P-8)对SBD-1的诱导表达受ERK1/2信号通路和p38信号通路的共同调控。本试验研究表明,乳杆菌能诱导RECs中SBD-1的差异性表达,并且L. plantarumP-8活菌对SBD-1的诱导表达是多条信号通路共同参与调控的,很可能通过TLR2-NF-κB/MAPKs(ERKl/2和p38)通路发生。