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蚕砂提取物(Silkworm feces extract,SFE)作为临床药物生血宁片的原料药,是由叶绿素衍生物铁和叶绿酸钠组成的一种水溶性铁络合物。研究表明,铁叶绿酸钠是一种血红素类似物,具有一定的抗贫血、抗炎、抗氧化等生物活性。本论文以蚕砂提取物为研究对象,体内建立缺铁性贫血大鼠和急性炎症小鼠模型,体外分别建立IL-6、BMP6和LPS诱导Hep G2细胞hepcidin高表达的细胞模型,并用蚕砂提取物对模型动物灌胃或与细胞共培养,通过一系列方法研究蚕砂提取物对缺铁性贫血和急性炎症的防治效果及作用机制,重点探讨了蚕砂提取物对hepcidin表达抑制作用及具体机制,为蚕砂提取物的临床应用提供理论依据。第一部分蚕砂提取物抑制缺铁性贫血大鼠hepcidin表达的作用及机制研究本部分研究采用低铁饲料持续喂养大鼠并定期眼眶内眦放血,同时灌胃蚕砂提取物溶液(27 mg/kg和54 mg/kg),每周监测血清铁和血常规。4周后,全自动血液分析仪检测血常规指标,蚕砂提取物组大鼠的Hb、RBC、HCT、MCV、MCH和MCHC较模型组显著升高,RDW-CV较模型组显著降低;原子吸收法检测血清铁和组织铁,蚕砂提取物组血清铁和组织铁较模型组均显著上升;试剂盒检测TIBC,蚕砂提取物显著降低了大鼠血清TIBC,升高了血清TSAT,表明蚕砂提取物能有效改善缺铁性贫血。为了明确蚕砂提取物对hepcidin表达是否有抑制作用,ELISA检测血清hepcidin,western blot检测hepcidin和ferroportin1蛋白,结果表明蚕砂提取物显著下调hepcidin的表达,上调ferroportin1的表达。进一步western blot检测hepcidin上游相关蛋白和IRP/IRE通路中相关蛋白,RIP实验检测IRP与IRE的亲和力,结果发现蚕砂提取物可下调p-JAK2、p-STAT3、BMP6、p-SMAD1/5/8、SMAD4和p38 MAPK的表达,从而抑制hepcidin的表达;且蚕砂提取物可激活IRP/IRE通路,上调IRP1、IRP2的表达,增强IRPs与IRE的亲和力,从而上调Tf R1的表达,下调ferritin-L的表达,从而促进组织铁释放。综上所述,蚕砂提取物不仅可以作为铁剂补充铁供应,还可以抑制hepcidin表达和激活IRP/IRE通路,促进组织铁的释放,有效改善缺铁性贫血。本部分的研究为缺铁性贫血的治疗提供新思路,也为蚕砂提取物的临床应用提供了一定的理论依据。第二部分蚕砂提取物抑制急性炎症小鼠hepcidin表达的作用及机制研究本部分实验我们先给小鼠灌胃蚕砂提取物(50 mg/kg)溶液6周,然后腹腔注射脂多糖(LPS,2μg/g)诱导急性炎症。观察肝脏组织H&E染色切片,模型组细胞间界限不清,炎性细胞浸润严重,而蚕砂提取物组细胞形态和炎性细胞浸润程度均明显改善;试剂盒检测血清SOD活力和MDA含量,模型组小鼠血清SOD活力无明显变化,MDA含量迅速升高,而蚕砂提取物组小鼠血清SOD活力显著增加,MDA含量较模型组显著降低。采用western blot检测hepcidin和相关蛋白,蚕砂提取物组hepcidin、NF-κB和p-STAT3蛋白水平较模型组均显著下降。综上所述,蚕砂提取物能有效缓解LPS诱导的急性炎症和氧化损伤,且蚕砂提取物能有效抑制LPS诱导的hepcidin高表达和炎性通路激活。本部分的研究为蚕砂提取物的临床应用提供了新的方向。第三部分蚕砂提取物体外抑制hepcidin表达的研究为了进一步明确蚕砂提取物抑制hepcidin表达的作用机制,我们体外构建IL-6、BMP6和LPS诱导Hep G2细胞hepcidin高表达的模型。在给予或不给予蚕砂提取物(200μg/m L)溶液共培养的情况下,分别用IL-6(50 ng/m L)、BMP6(25 ng/m L)或LPS(1μg/m L)刺激Hep G2细胞。Western blot和q RT-PC检测分析相关蛋白和hepcidin m RNA的表达情况。结果表明,IL-6刺激后,hepcidin m RNA、p-STAT3和p-JAK2的表达显著升高,而蚕砂提取物共培养组明显逆转了IL-6的诱导作用;BMP6刺激后,hepcidin m RNA、p-SMAD1/5/8和SMAD4的表达显著升高,而蚕砂提取物干预后明显抵消了BMP6的诱导作用;LPS显著上调了hepcidin、NF-κB和p-STAT3的蛋白水平,而蚕砂提取物组共培养后明显抑制了LPS的诱导效果。总而言之,体外实验进一步验证蚕砂提取物能抑制JAK2/STAT3和BMP6/SMAD通路,下调hepcidin的表达。